孫曉青, 陳志武

尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ, UⅡ)最初是從硬骨魚垂體腺中分離出來的一種環(huán)形結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)肽，人尾加壓素Ⅱ(human UII, hU Ⅱ)含有11個氨基酸, 主要表達(dá)在心血管系統(tǒng), 越來越多的研究[1-2]表明由hU Ⅱ及其受體(UT受體)組成的urotensin系統(tǒng)對機(jī)體心血管生理功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。映山紅花，系杜鵑科植物，在我國具有廣泛的分布，是一種重要的中藥資源。映山紅花總黃酮(total flavones of rhododendra, TFR)系從映山紅花中提取的黃酮類有效部位，其主要成分為槲皮素、金絲桃苷及蘆丁等化合物[3]。課題組前期研究表明TFR能夠抗大鼠心肌缺血性損傷[4]，并抑制心肌梗死后心室重構(gòu)[5]，但不清楚TFR是否通過直接影響心肌細(xì)胞的收縮性來發(fā)揮抗心肌缺血性損傷作用。該研究觀察了TFR對體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞收縮性的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物1 d 齡SPF級新生SD大鼠，雌雄各半，共64只，體質(zhì)量5.5～6.5 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物飼養(yǎng)于安靜、通風(fēng)良好和有空氣過濾系統(tǒng)的環(huán)境中，12 h日光燈晝夜循環(huán)，保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對濕度(50±5)%。

1.2主要試劑TFR購自合肥合源醫(yī)藥科技有限公司，黃色粉末，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)85%以上，實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配成所需濃度；hU Ⅱ、Ⅱ型膠原酶、TRIton X-100、鈣熒光探針Fluo-8 AM購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國BI公司；胰酶購自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司；FITC標(biāo)記的山羊抗鼠熒光二抗購于美國Proteintech公司；α-橫紋肌肌動蛋白(α-Sarcomeric actin，α-SCA)單克隆抗體購自武漢博士德生物有限公司；DAPI染色液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3新生大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定新生大鼠(每次10只)固定于超凈工作臺上,用75%酒精消毒其皮膚，打開胸腔取出心臟，在盛有PBS緩沖液的平皿中清洗之后，剪掉心房，把心室放在另一平皿中，用PBS緩沖液反復(fù)清洗3次；將一定數(shù)目的心室放進(jìn)青霉素小瓶中，將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎塊；將心肌組織的碎塊，加入0.25%胰酶和0.1% Ⅱ型膠原酶(1 ∶1)的混合消化液，反復(fù)吹打3 min后蓋緊, 放入溫箱中孵育5 min，取出后再反復(fù)吹打3 min，待自然沉降后棄去上清液；剩余沉淀再加入2 ml消化液，反復(fù)吹打3 min后放入37 ℃溫箱中消化8 min，靜置后用吸管將上清液移入10 ml離心管中，剩余沉淀用同樣條件及方法繼續(xù)消化；每次消化產(chǎn)物以1 000 r/min離心8 min，輕輕用吸管棄去上清液后，將細(xì)胞重懸于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞懸液用200目銅網(wǎng)過濾后接種在培養(yǎng)皿；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，輕輕將細(xì)胞懸液吸出，以4×105個/ml的密度接種在24孔培養(yǎng)板上，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天更換培養(yǎng)液，并用含10 μmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶的培養(yǎng)液維持48 h，以抑制非心肌細(xì)胞的增殖。以后每2 d換液1次。① 形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的大小、形態(tài)、搏動情況、生長特性及排列方式等；② 取無菌的小蓋玻片放入24孔板內(nèi)，取培養(yǎng)的心肌細(xì)胞加入到24孔板，進(jìn)行培養(yǎng)，制成細(xì)胞爬片。等細(xì)胞培養(yǎng)到第3天棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗爬片2次，用含0.3% TRIton X-100(PBS緩沖液稀釋)的多聚甲醛室溫下固定30 min，棄去多聚甲醛，用PBS洗3次，室溫下加山羊血清封閉液30 min；棄去封閉液，加入1 ∶50 稀釋的小鼠抗大鼠α-SCA單克隆抗體于4 ℃過夜(陰性對照用PBS代替)，PBS 洗3次；1 ∶100稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗鼠二抗室溫孵育2 h，PBS洗3次；DAPI染色液孵育10 min，PBS洗3次；抗熒光淬滅液封片后立即置于倒置熒光顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4心肌細(xì)胞收縮頻率和收縮幅度的測定將上述培養(yǎng)的原代新生大鼠心肌細(xì)胞移入6孔培養(yǎng)板中，分別加入PBS、各濃度的TFR(3.7、11.1、33.3、100、300 mg/L)或hU Ⅱ(10、100 nmol/L)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后于1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用PBS快速沖洗2次，細(xì)胞調(diào)成1×106個/ml的密度，再次移入6孔培養(yǎng)板中，倒置顯微鏡下觀察單個心肌細(xì)胞搏動情況，計(jì)數(shù)其搏動頻率，并用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件測量細(xì)胞面積(m2)，以一個心動周期內(nèi)細(xì)胞的最大面積和最小面積之間的差值占最大面積的百分比作為細(xì)胞的收縮幅度(%)。每個培養(yǎng)孔中觀察10個細(xì)胞，以其平均搏動頻率和平均收縮幅度為觀察指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)6次。另取一批細(xì)胞，先用100 nmol/L hU Ⅱ預(yù)處理48 h后，再加入各濃度的TFR后，同樣方法測定細(xì)胞的平均搏動頻率和平均收縮幅度。

1.5心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的測定加藥處理后，細(xì)胞爬片用臺式緩沖液(pH 7.4)(5 mmol/L KCl，130 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgSO4，2 mmol/L CaCl2，8 mmol/L NaOH，20 mmol/L HEPES)清洗3次，以終濃度0.2%的Fluo-8 AM 2 μl加入2 ml臺氏液中，37 ℃孵育30 min，之后用PBS清洗3次，通過氬激光器進(jìn)行激光圖像采集，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為520 nm，采集頻率被設(shè)置為每10 s一個圖像。徠卡DMLFSA顯微鏡下使用Metafluor成像系統(tǒng)中集成CCD(電荷耦合器件)相機(jī)記錄單視野內(nèi)細(xì)胞內(nèi)鈣熒光成像并通過圖像分析軟件分析圖像中興趣區(qū)域內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化，間接反映細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+濃度。

2 結(jié)果

2.1新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定光學(xué)顯微鏡下觀察，剛分離的心肌細(xì)胞呈圓形，然后變?yōu)樗笮危?4 h后細(xì)胞基本貼壁，單個細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動，搏動頻率和節(jié)律有所不同；48 h后伸出偽足，細(xì)胞相互接觸，交織成網(wǎng)，細(xì)胞搏動趨于同步化。見圖1。用免疫熒光法檢測原代心肌細(xì)胞中特異性α-SCA蛋白，在原代心肌細(xì)胞中α-SCA抗原表達(dá)呈陽性，且位于胞質(zhì)中，DAPI染色的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。高倍鏡下取數(shù)個視野，計(jì)算其平均值，結(jié)果顯示陽性細(xì)胞率為98%。見圖2。

圖1 光鏡下原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞 ×200

2.2hUⅡ?qū)π募〖?xì)胞收縮頻率的影響在給予hU Ⅱ前,各組心肌細(xì)胞收縮頻率并無差異；與對照組比較，hU Ⅱ 10、100 nmol/L作用48 h能夠加快心肌細(xì)胞的收縮頻率(F=78.16，P<0.05)。見表1。

表1 hUⅡ?qū)π募〖?xì)胞收縮頻率的影響

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3hUⅡ?qū)π募〖?xì)胞收縮幅度的影響在給予hU Ⅱ前,各組心肌細(xì)胞收縮幅度并無差異；與對照組比較，hU Ⅱ 10 nmol/L處理48 h能夠增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮幅度(t=2.56，P<0.05),而hU Ⅱ 100 nmol/L處理48 h能夠降低心肌細(xì)胞收縮幅度(t=5.41，P<0.01)。見表2。

圖2 心肌細(xì)胞中α-SCA抗原表達(dá) 免疫熒光染色×400

表2 hUⅡ?qū)π募〖?xì)胞收縮幅度的影響

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4TFR對心肌細(xì)胞收縮頻率的影響藥物作用時間為30 min，與對照組比較，TFR 3.7～100 mg/L濃度對心肌細(xì)胞收縮頻率幾乎無影響，而TFR 300 mg/L能夠減慢心肌細(xì)胞收縮頻率(F=2.932，P<0.05)。見表3。

表3 TFR對心肌細(xì)胞收縮頻率的影響

與對照組比較：*P<0.05

2.5TFR對心肌細(xì)胞收縮幅度的影響藥物作用30 min后，與對照組比較，TFR 3.7～100 mg/L對心肌細(xì)胞收縮幅度幾乎無影響，而TFR 300 mg/L能夠增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮幅度(F=3.48，P<0.05)。見圖3。

圖3 TFR對心肌細(xì)胞收縮幅度的影響

1：對照組；2：TFR 3.7 mg/L組；3：TFR 11.1 mg/L組；4：TFR 33.3 mg/L組；5：TFR 100 mg/L組；6：TFR 300 mg/L組；與對照組比較：*P<0.05

2.6TFR對hUⅡ預(yù)處理心肌細(xì)胞收縮頻率的影響與給予hU Ⅱ前比較，給予hU Ⅱ處理48 h后，心肌細(xì)胞收縮頻率增加(t=6.92、6.91、7.79、9.28、6.88、8.82，P<0.05)；與對照組比較，TFR 33.3～300 mg/L能夠濃度依賴性地減弱hU Ⅱ引起的心肌細(xì)胞收縮頻率的增加(F=17.53，P<0.05)。見表4。

表4 TFR對hUⅡ預(yù)處理心肌細(xì)胞收縮頻率的影響

與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與給予hUⅡ前比較：#P<0.05

2.7TFR對hUⅡ預(yù)處理心肌細(xì)胞收縮幅度的影響心肌細(xì)胞以100 nmol/L hUⅡ預(yù)處理48 h，然后再給予不同濃度的TFR處理30 min。與對照組比較，給予hUⅡ 100 nmol/L 處理48 h后，心肌細(xì)胞收縮幅度下降(t=2.504,P<0.01)，與單獨(dú)給予hUⅡ 100 nmol/L組比較，TFR 33.3～300 mg/L能夠改善hUⅡ引起的心肌細(xì)胞收縮幅度的下降(F=16.76,P<0.05 )。見圖4。

圖4 TFR對hUⅡ預(yù)處理心肌細(xì)胞收縮幅度的影響

1：對照組；2：hUⅡ 100 nmol/L組；3：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 3.7 mg/L 組；4：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 11.1 mg/L組；5：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 33.3 mg/L組；6：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 100 mg/L組；7：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 300 mg/L組；與對照組比較：**P<0.01；與hUⅡ 100 nmol/L組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.8TFR對hUⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+含量增加的影響與對照組比較，加入10 nmol/L hU Ⅱ處理48 h，可顯著地增加心肌細(xì)胞在488 nm波長光激發(fā)下，在520 nm處產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，100 nmol/L hU Ⅱ進(jìn)一步增加心肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(F=669.67，P<0.01)；但TFR 100 mg/L可明顯地抑制100 nmol/L hU Ⅱ誘導(dǎo)該熒光強(qiáng)度的增加(t=13.32，P<0.01)，結(jié)果表明TFR可顯著地抑制hU Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+含量增加。見圖5。

3 討論

心肌細(xì)胞收縮頻率的降低可減少心肌耗氧量，而收縮幅度的增強(qiáng)可增加心肌耗氧量。本研究應(yīng)用原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞，顯示TFR能夠減慢心肌細(xì)胞收縮頻率，但增加心肌細(xì)胞的收縮幅度。因此，TFR減慢心肌細(xì)胞收縮頻率可能抵消其增加心肌細(xì)胞收縮幅度引起的心肌耗氧量的增加，提示TFR有可能在不增加心肌耗氧量的情況下加強(qiáng)心肌收縮性，這對改善心肌缺血性損傷導(dǎo)致的心功能下降是有利的。

圖5 hUⅡ及TFR對心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的影響

1：對照組；2：hUⅡ 10 nmol/L組；3：hUⅡ 100 nmol/L組；4：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 100 mg/L組；與對照組比較：**P<0.01；與hUⅡ 100 nmol/L組比較：##P<0.01

大量研究[6-7]表明hU Ⅱ與UT受體結(jié)合能夠產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，并在多種心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用，是很有前景的治療新靶點(diǎn)。本研究顯示hU Ⅱ在10 nmol/L能夠增加心肌細(xì)胞收縮幅度，而在100 nmol/L反而降低心肌細(xì)胞收縮幅度，表明高低不同濃度的hU Ⅱ?qū)π募〖?xì)胞收縮性的影響是不同的，這與Dong et al[8]的研究結(jié)果較相似，結(jié)果顯示UⅡ?qū)ρ茏饔贸孰p相性，即濃度小于10-9mol /L可產(chǎn)生內(nèi)皮依賴性舒張作用，而超過10-9mol /L可直接收縮血管平滑肌。但是本研究表明，無論是10 nmol/L hU Ⅱ，還是100 nmol/L hU Ⅱ均可明顯地增加心肌細(xì)胞收縮頻率。

文獻(xiàn)[9]報(bào)道hU Ⅱ可通過UT受體增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量。本實(shí)驗(yàn)也顯示hU Ⅱ在10和100 nmol/L濃度時能夠增加心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。心肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)不如骨骼肌發(fā)達(dá)，貯Ca2+量少，其收縮有賴于細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流。10 nmol/L hU Ⅱ引起細(xì)胞內(nèi)的Ca2+增加，對于心肌細(xì)胞的收縮力是一種正性促進(jìn)作用，這與Al et al[10]的報(bào)道，hU Ⅱ在20 pmol/L～20 nmol/L能夠濃度依賴性地增加右心室收縮力的結(jié)論相一致。文獻(xiàn)[11]報(bào)道過度增加Ca2+內(nèi)流將誘導(dǎo)細(xì)胞肥大[12]，并且導(dǎo)致其收縮功能受損。這就可以解釋為什么100 nmol/L hU Ⅱ在進(jìn)一步增加心肌細(xì)胞的鈣濃度時，反而降低心肌細(xì)胞收縮幅度。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流的增加可導(dǎo)致其自律性的增加，收縮頻率是衡量自律性的一個指標(biāo)，故而10和100 nmol/L hU Ⅱ均能夠增加心肌細(xì)胞收縮頻率。

本研究顯示TFR在33.3～300 mg/L范圍內(nèi)，可濃度依賴性地抑制100 nmol/L hU Ⅱ引起的心肌細(xì)胞收縮幅度的下降和收縮頻率的增加，改善心肌細(xì)胞收縮性。進(jìn)一步研究還表明TFR可減少100 nmol/L hU Ⅱ?qū)е碌男募〖?xì)胞Ca2+含量的增加。研究[13]表明TFR能與UT受體競爭性結(jié)合從而拮抗hU Ⅱ的作用，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，可以推測TFR通過抑制hU Ⅱ與UT受體的結(jié)合，減少細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度， 從而改善心肌細(xì)胞的收縮性。