霍穎玙 ，趙 娟 ，李憲德 ，王海凈 ，王曉丹 ，胡鵬剛 ，邱樹毅

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025； 2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025； 3.山東楊湖酒業(yè)有限公司，山東菏澤274000）

白酒是中國(guó)傳統(tǒng)蒸餾酒，根據(jù)生產(chǎn)工藝的不同，白酒分為不同香型，醬香型白酒以茅臺(tái)為代表，具有“醬香突出，優(yōu)雅細(xì)膩，酒體醇厚，香味協(xié)調(diào)，回味悠長(zhǎng)，空杯留香持久”的特點(diǎn)[1]，深得廣大消費(fèi)者的喜愛。醬香酒的核心產(chǎn)區(qū)在貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)，其炎熱、濕潤(rùn)的氣候特點(diǎn)，使得微生物易于生長(zhǎng)，十分有利于釀造醬香白酒微生物的棲息、生長(zhǎng)和繁殖。我國(guó)北方地區(qū)也生產(chǎn)醬香型白酒，但由于干燥、寒冷等氣候特點(diǎn)，不適于釀造醬香白酒微生物的棲息、繁殖和生長(zhǎng)，因此所產(chǎn)醬香型白酒質(zhì)量和產(chǎn)量均不如茅臺(tái)鎮(zhèn)核心產(chǎn)區(qū)，釀造的白酒醬香風(fēng)味較差。通過制作出醬香型強(qiáng)化麥曲，以彌補(bǔ)氣候與地域環(huán)境給釀造醬香白酒帶來的缺陷。增加醬香型白酒的產(chǎn)量和豐富醬香型白酒的風(fēng)味，對(duì)提高北方醬香型白酒釀造品質(zhì)的意義重大。

近年來，許多學(xué)者對(duì)白酒的醬香風(fēng)味展開研究。張榮等[2]從高溫大曲中分離得到了3株產(chǎn)醬香的菌，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液在6 d后呈現(xiàn)明顯的醬香，并在發(fā)酵液中檢測(cè)到了乙偶姻、四甲基吡嗪以及呋喃扭爾。ZHU B F等[3]從高溫大曲中分離得到枯草芽孢桿菌，研究表明，枯草芽孢桿菌利用乙偶姻產(chǎn)四甲基吡嗪，而且該菌發(fā)酵液中四甲基吡嗪含量可達(dá)到4.08 g/L。徐巖等[4]對(duì)中國(guó)白酒中四甲基吡嗪的來源及產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行了研究，研究驗(yàn)證了中國(guó)白酒中四甲基吡嗪產(chǎn)生的主要途徑來源于微生物的代謝反應(yīng)，而不是美拉德反應(yīng)。本課題組[5]也從高溫大曲中篩選出兩株地衣芽孢桿菌，將這兩株菌株模擬白酒生產(chǎn)固態(tài)發(fā)酵，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析表明，該兩株菌的風(fēng)味物質(zhì)成分中吡嗪類物質(zhì)含量均較高，并且以四甲基吡嗪為主。本研究將篩選出的高產(chǎn)吡嗪類的地衣芽孢桿菌添加到制曲小麥粉中制成麥曲，以提高麥曲中吡嗪類物質(zhì)的含量，從而達(dá)到豐富麥曲醬香風(fēng)味的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

FBKL 1.0199與FBKL 1.0201，本課題組從貴州茅臺(tái)鎮(zhèn)醬香型白酒生產(chǎn)用曲中分離篩選得到，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌。

1.1.2 試劑

制曲小麥粉來源于山東楊湖酒業(yè)有限公司，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏4 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、葡萄糖5 g、蒸餾水1000 mL，pH7.0～7.2，0.1 MPa壓力滅菌30 min。

淺盤培養(yǎng)基：麩皮1500 g，加水60%（接入液體三角瓶后含水100%），拌勻，0.1 MPa壓力殺菌60 min。

簾子種曲培養(yǎng)基：麩皮15 kg，加水90%，拌勻堆積潤(rùn)料30 min，0.1 MPa滅菌60 min，取出降溫至45℃。

通風(fēng)曲培養(yǎng)基：小麥300 kg，潑入約400 kg的水，0.1 MPa壓力蒸料40 min，降溫至50℃。

1.2 儀器與設(shè)備

Stable Flex纖維頭（DVB/CAR/PDMS），美國(guó)Supelco公司；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；FA1004電子天平，上海箐海儀器有限公司；TDL-5低速離心機(jī)，南京東邁科技儀器有限公司；KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌液的制備

從活化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上挑取地衣芽孢桿菌菌落至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定

采用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)，37℃倒置培養(yǎng)24 h，記錄菌落總數(shù)。

1.3.3 麥曲理化指標(biāo)的測(cè)定

參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中的測(cè)定方法對(duì)大曲水分、淀粉、酸度、液化力、糖化力、酯化力、發(fā)酵力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 GC-MS分析實(shí)驗(yàn)

采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）技術(shù)結(jié)合GC-MS分析麥曲中揮發(fā)性成分及吡嗪類物質(zhì)的含量[6-11]。

樣品處理：取麥曲15 g，研磨充分后加入30 mL蒸餾水浸泡10 min，然后超聲波處理30 min，取出離心或過濾，吸取上清液5 mL于15 mL萃取瓶中，加入 1.5 g NaCl。插入裝有 2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS Stable Flex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在60℃左右頂空萃取40 min后取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（溫度250℃）中，熱解吸3 min進(jìn)樣。采用全掃描模式對(duì)樣品中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)。

氣相色譜條件：色譜柱CP-WAX（30m×0.25mm×0.25μm)彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫35℃（保持5min），以4℃/min升溫至135℃，再以8℃/min升溫至180℃保持5 min，運(yùn)行時(shí)間43 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純氦（He）（99.999%）；柱前壓7.62 psi，載氣流速0.8 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比為20∶1；溶劑延遲時(shí)間2 min。質(zhì)譜條件：電子電離源（electron ionization，EI），離子源溫度230 ℃，接口溫度250℃。

對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢測(cè)及核對(duì)Nist2005和Wiley標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定了揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測(cè)定了各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 強(qiáng)化細(xì)菌的特性

FBKL1.0199、FBKL1.0201菌株經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌，其模擬白酒固態(tài)發(fā)酵的揮發(fā)性成分分析結(jié)果見圖1。

由圖1可知，這兩株菌在模擬白酒固態(tài)發(fā)酵時(shí)，其揮發(fā)性成分種類較多，包括醇、醛、酮、酯、酚、吡嗪等，對(duì)醬香型白酒風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的吡嗪類物質(zhì)含量分別達(dá)到46.01%和48.32%。經(jīng)課題組應(yīng)用于醬香型白酒生產(chǎn)實(shí)踐中，可以明顯提升醬香型白酒基酒的醬香風(fēng)味。

圖1 FBKL1.0199、FBKL1.0201模擬固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分百分含量圖

2.2 強(qiáng)化醬香麥曲的制備

強(qiáng)化醬香純種麥曲的制備工藝如下：

液體三角瓶培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，將菌種用接種針各接1環(huán)于三角瓶中，每個(gè)菌種接3只三角瓶，然后于37℃培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)效果：FBKL1.0199菌液呈黃色，渾濁，液面布滿白色菌膜，微粉色，搖瓶后菌膜似蛋花樣聚在一起，類似臭雞蛋氣味。FBKL1.0201液體呈黃色，渾濁，液面布滿白色菌膜，搖瓶后菌膜散浮于液面，稍臭，有豆豉味，空瓶略顯焦香味。

淺盤培養(yǎng)：滅菌后揚(yáng)麩攤晾至45℃以下，接入液體三角瓶，拌勻于37℃培養(yǎng)箱中保溫培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束，聞之有氨味。

簾子種曲培養(yǎng)：按10%的比例接入淺盤曲種，拌勻。接種后上簾培養(yǎng)，曲料厚1～1.5 cm，厚薄均勻。攤料結(jié)束將已滅菌的薄膜蓋在上面?？刂剖覝卦?7～40℃，品溫37～50℃，可采用劃簾和調(diào)整室溫以控制品溫。接種30 h，生長(zhǎng)旺盛，可揭去薄膜，培養(yǎng)48 h后，曲種出現(xiàn)刺鼻的氨味，將室溫控制至40℃進(jìn)行排濕干燥。

通風(fēng)曲培養(yǎng)：將小麥散冷至40～50℃，按5%的比例接入種曲拌勻。小麥裝箱后進(jìn)入靜置培養(yǎng)，控制室溫40℃，品溫37～45℃，12 h后翻曲1次，控制品溫40～55℃之間。24 h和36 h后各翻曲1次，控制品溫45～60℃之間。約48 h出房。成曲有刺鼻的氨味，并拌有豆豉味。

2.3 強(qiáng)化醬香純種麥曲理化指標(biāo)

強(qiáng)化醬香純種麥曲的理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 麥曲理化指標(biāo)

對(duì)照地方標(biāo)準(zhǔn)DB 52/T871—2014《醬香型白酒釀酒用大曲》檢測(cè)分析指標(biāo)。由表1可知，麥曲中水分含量、酸度均符合醬香型大曲成品曲的指標(biāo)要求，水分、酸度在規(guī)定范圍內(nèi)（水分≤13%，酸度1.0～3.5 mmol/10 g）。對(duì)原料小麥的淀粉的利用率在12.38%～16.44%之間。其中，淀粉含量、糖化力標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定范圍：淀粉含量53.0～60.0 g/100 g，糖化力100～300 U，實(shí)際測(cè)得值偏小。液化力能力很低。這很有可能是因?yàn)辂溓谥谱鬟^程中菌種太過單一，其中芽孢桿菌的菌落總數(shù)為2.24×108cfu/g。

2.4 GC-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將接入功能性菌株發(fā)酵的麥曲混合后進(jìn)行HS-SPME結(jié)合GC-MS分析。麥曲GC-MS總離子圖見圖2，成分分析見表2、圖3。

由表2、圖3可知，麥曲中共檢測(cè)到10種物質(zhì)，醛類物質(zhì)1種，酮類物質(zhì)1種，醇類物質(zhì)2種，酸類物質(zhì)4種，吡嗪類物質(zhì)2種。其中酸類物質(zhì)百分含量最高，為39.29%，其次是吡嗪類化合物相對(duì)百分含量，為32.8%，其中以四甲基吡嗪為主，含量為31.11%。其次是醇類化合物，含量為25.64%，醛類物質(zhì)和酮類物質(zhì)含量較低，分別為0.53%和0.33%。還有一些其他的烷烴類、雜環(huán)類和未確定的化合物，總含量為1.41%。

圖2 麥曲GC-MS總離子流圖

表2 麥曲GC-MS成分分析

圖3 麥曲揮發(fā)性成分百分含量圖

3 結(jié)論

本研究將從高溫醬香大曲中分離所得到的功能性地衣芽孢桿菌直接加入到小麥里，經(jīng)過高溫發(fā)酵，使得地衣芽孢桿菌在小麥里形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，得到純種麥曲。所制得的麥曲中地衣芽孢桿菌數(shù)量為2.24×108cfu/g。同時(shí)測(cè)定了麥曲的理化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)所制得麥曲酯化力強(qiáng)，但糖化力和液化力偏低。對(duì)麥曲的風(fēng)味成分進(jìn)行了HS-SPME結(jié)合GC-MS分析，證實(shí)麥曲中的風(fēng)味成分以吡嗪類物質(zhì)為主，吡嗪類物質(zhì)所占的相對(duì)百分含量為32.8%，其中四甲基吡嗪的含量為31.11%。