（1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 皮膚科，河南 洛陽(yáng)，471000；2.洛陽(yáng)市第二中醫(yī)院皮膚科，河南 洛陽(yáng)，471003）

白癜風(fēng)是皮膚科常見(jiàn)多發(fā)難治性色素障礙性疾病，嚴(yán)重影響患者皮膚外觀美容，導(dǎo)致患者極大的精神壓力和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。白癜風(fēng)的病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍未明確[1]。目前西醫(yī)治療白癜風(fēng)方法很多，如光化學(xué)療法，免疫療法、自體表皮移植及黑素細(xì)胞移植等[2]，但療效不理想或有一定副作用，存在著較大的局限性。相比之下，某些中藥制劑在白癜風(fēng)治療方面已取得了令人滿(mǎn)意的效果 ，但具體作用機(jī)制研究較少。女貞子具有滋補(bǔ)肝腎，明目烏發(fā)的功能。藥理研究表明女貞子具有護(hù)肝、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老等作用[3]，還可上調(diào)酪氨酸酶活性，促進(jìn)黑素合成。干細(xì)胞因子(SCF)及其受體c-kit對(duì)黑素細(xì)胞的分化、增殖、遷移具有重要作用。前期研究顯示，與正常對(duì)照組相比，白癜風(fēng)皮損毛囊無(wú)色素黑素細(xì)胞（AMMC）上c-kit表達(dá)顯著減少，提示白癜風(fēng)皮損毛囊SCF/c-kit信號(hào)通路可能存在異常受損從而致黑素細(xì)胞功能失調(diào)[4]。鑒于此，本研究旨在探討女貞子乙醇提取物對(duì)人毛囊無(wú)色素黑素細(xì)胞c-kit表達(dá)的影響，并以此為切入點(diǎn)，探討白癜風(fēng)的治療新途徑。

1 試劑與材料

1.1 研究材料

皮膚標(biāo)本取自人正常頭皮(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診外科提供)，4℃環(huán)境下以DMEM培養(yǎng)基貯存，貯存時(shí)間不超過(guò)48h。

1.2 主要研究試劑

兔抗人酪氨酸激酶受體抗體、B-actin抗體、鼠抗人T311酪氨酸酶單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)；0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(杭州吉諾)，中性蛋白分離酶(dispase)(廣州威佳)，M254培養(yǎng)基、人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(HMGS)、Transwell培養(yǎng)板(美國(guó)Cascade)，即用型SP免疫組化試劑盒(福建邁新)，RNase(上海瑞齊)，瓊脂糖凝膠(上海艾研)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)。

2 方 法

2.1 中藥提取

參照李永偉等[5]制定的方法。

2.2 毛囊無(wú)色素黑素細(xì)胞培養(yǎng)

參照王大光等[6]制定的方法進(jìn)行。

2.3 細(xì)胞增殖

參照李永偉[7]方法，配制0，2，0.67，0.22，0.07，0.03 mg／mL含女貞子乙醇提取物濃度的TICVA培養(yǎng)基。無(wú)色素黑素細(xì)胞用dispase酶消化傳代后第2天加入所配培養(yǎng)基于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，72 h后Coulter Counter計(jì)數(shù)，確定最佳濃度。然后加入現(xiàn)配XTY/PMS顯色液，490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度(A值)。

2.4 c-kit 表達(dá)

以每孔1×105個(gè)，將培養(yǎng)液接種于6孔培養(yǎng)板，37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，去除上清，加入女貞子提取物，培養(yǎng)72 h終止。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，僅添加M254完全培養(yǎng)基。設(shè)計(jì)PCR引物[8]，RT-PCR測(cè)定c-kit mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS23.0軟件，采用重復(fù)測(cè)量方差分析或獨(dú)立樣本 檢驗(yàn)， P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，濃度為2，0.67，0.22，0.07，0.03 mg／mL女貞子乙醇提取物對(duì)毛囊無(wú)色素黑素細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用(F=9.34，P＜0.01)，其中0.22mg/mL促進(jìn)作用最為顯著(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度女貞子提取物對(duì)毛囊無(wú)色素黑素細(xì)胞的促增殖作用(n=10)

3.2 c-kit表達(dá)

對(duì)照組c-kit mRNA表達(dá)值為(0.125±0.023)，而0.22mg/mL組為(0.647±0.046)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=10， =-32.096，P＜0.001)。

4 討 論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，白癜風(fēng)病因病機(jī)主要為“肝腎不足”，肝腎不足則“皮毛膝里失養(yǎng)而發(fā)白斑”，因此臨床多采用“補(bǔ)益肝腎”法治療。女貞子具有滋補(bǔ)肝腎，明目烏發(fā)的功能，其主要有效成分為酪醇和齊墩果酸，其中酪醇具有較強(qiáng)的抗氧化、抗疲勞、抗毒、抗微波輻射等護(hù)體強(qiáng)健功效，而齊墩果酸則可抗炎、抗病毒、抗氧化、抗突變、增強(qiáng)肌體免疫力。女貞子提取物可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的聚合，促進(jìn)黑素細(xì)胞的黏附及遷移。

臨床觀察顯示，白癜風(fēng)復(fù)色時(shí)多是先從白斑毛囊口出現(xiàn)色素沉著，漸向外周擴(kuò)展，最后融合成片；表明白癜風(fēng)復(fù)色主要是皮損區(qū)毛囊黑素細(xì)胞的增殖和遷移。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)毛囊外毛根鞘無(wú)色素黑素細(xì)胞的解剖結(jié)構(gòu)、形態(tài)學(xué)、體外活化黏附和移行方面都進(jìn)行研究，認(rèn)為毛囊無(wú)色素黑素細(xì)胞位于外毛根鞘的中下段，形態(tài)類(lèi)似于周邊的毛皮質(zhì)細(xì)胞，外觀胞體偏圓，樹(shù)突不明顯，數(shù)目較少，常成群集中分布，胞質(zhì)中充滿(mǎn)黑素體，多為Ⅱ、Ⅲ期黑素小體，其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致功能上的不成熟。毛囊無(wú)色素黑素細(xì)胞是靜止?fàn)顟B(tài)的黑素細(xì)胞，是表皮黑素細(xì)胞的干細(xì)胞和儲(chǔ)庫(kù)，能夠?yàn)樘囟ㄒ蛩厮せ?，分化增殖從無(wú)活性狀態(tài)慢慢成熟為有活性狀態(tài)并沿著外毛根鞘遷移到附近的表皮，形成色素島，在白癜風(fēng)復(fù)色過(guò)程中有著極為重要的作用，而SCF/c-kit信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)黑素細(xì)胞的分化、增殖、遷移均具有關(guān)鍵作用[9]。

在本研究中，我們通過(guò)設(shè)置不同濃度的女貞子乙醇提取物，研究其對(duì)無(wú)色素黑素細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示，不同濃度的女貞子提取物均可促進(jìn)無(wú)色素黑素細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步進(jìn)行RT-PCR測(cè)定c-kit mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯示，與對(duì)照組相比較， 0.22mg/mL的女貞子提取物的c-kit mRNA的相對(duì)表達(dá)量具有顯著優(yōu)勢(shì)，為(0.647±0.046)。

我們前期研究顯示[10]，白癜風(fēng)皮損毛囊AMMC上c-kit表達(dá)顯著減少，提示白癜風(fēng)皮損毛囊SCF/c-kit信號(hào)通路可能存在異常受損從而致黑素細(xì)胞功能失調(diào)。而結(jié)合本次研究結(jié)果，我們認(rèn)為女貞子乙醇提取物有可能是通過(guò)SCF/c-kit信號(hào)途徑激活毛囊外毛根鞘的無(wú)色素黑素細(xì)胞，使其分化增殖并遷移至表皮基底層而發(fā)揮治療白癜風(fēng)的作用。