李彩瑩，梁雨亭，王 丹，塔 娜，趙德超

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科， 哈爾濱 150001)

中性粒細(xì)胞是機(jī)體抵御病原體入侵的第一道免疫防線，是非特異性免疫的重要組成部分。中性粒細(xì)胞是最早到達(dá)炎癥部位的免疫細(xì)胞，通過吞噬、釋放殺菌顆粒、產(chǎn)生細(xì)胞因子等方式消滅并防止病原微生物在體內(nèi)擴(kuò)散[1]。除以上方式外，中性粒細(xì)胞還存在另一種免疫防御機(jī)制——中性粒細(xì)胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs是中性粒細(xì)胞活化后釋放的由細(xì)胞質(zhì)和顆粒蛋白組成的胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是一種新型的抗微生物機(jī)制。目前認(rèn)為NETs是先天性免疫反應(yīng)的一種形式，不僅可以捕獲、殺滅以及阻止細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原微生物的擴(kuò)散，還可導(dǎo)致超炎癥病理學(xué)[2]，在感染性疾病中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥、痛風(fēng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthitis,RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、小血管炎等非感染性炎性疾病與NETs過量產(chǎn)生或清除障礙密切相關(guān)[3-5]。現(xiàn)從NETs的形成、抗菌性及其在炎性疾病中的意義等進(jìn)行概述。

1 NETs概述

1.1NETs的組分及效應(yīng) NETs是中性粒細(xì)胞受刺激,核內(nèi)染色質(zhì)解聚后釋放到胞外的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，面積是濃縮染色質(zhì)的3～5倍，其以DNA為骨架，上鑲嵌有組蛋白以及超過30種初級和次級顆粒組分[6]，其中一些組分具有殺菌活性，如彈性蛋白酶、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、組織蛋白酶G、乳鐵蛋白、穿透素3、明膠酶、蛋白酶3、抗菌肽、肽聚糖結(jié)合蛋白等[7]，這些鑲嵌在DNA骨架上的蛋白增強(qiáng)了NETs的抗微生物作用，可作為生物酶和殺菌劑，其被釋放到組織和血液時，能夠引起炎癥反應(yīng)和血栓形成，從而加重宿主損傷。在炎性相關(guān)的自身免疫性疾病中，NETs組分也可作為抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[8]。因此，NETs在炎性疾病中的效應(yīng)具有雙重屬性。

1.2NETs形成機(jī)制和影響因素 中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)是區(qū)別于凋亡和壞死的另一條細(xì)胞死亡途徑，隨后對其進(jìn)行了詳細(xì)研究，并命名為NETosis。病原微生物、脂多糖、佛波酯、活化的血小板等都能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs。有報道指出，組織損傷引起全身炎癥反應(yīng)的患者的血漿也可以刺激中性粒細(xì)胞釋放NETs，其原因可能與血漿中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的增多有關(guān)[9]。

目前，NETs產(chǎn)生的分子機(jī)制尚未完全清楚。已知的NETosis有3種模式:①自殺性NETosis，持續(xù)2～4 h，是目前了解的最多的一種模式[10]。應(yīng)用佛波酯刺激中性粒細(xì)胞后激活還原型輔酶氧化酶復(fù)合物，促進(jìn)活性氧的生成。同時細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+增加,其作為肽基精氨酸脫氨酶4的輔因子，加速組蛋白瓜氨酸化及染色質(zhì)解聚[8]?；钚匝踝鳛樽詺⑿訬ETosis的第二信使，能促進(jìn)核膜裂解。此外，嗜天青顆粒釋放的彈性蛋白酶和MPO進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)染色體解聚并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后與胞質(zhì)蛋白和顆粒毒素結(jié)合釋放到細(xì)胞外[9]?；钚匝醯漠a(chǎn)生和肽基精氨酸脫氨酶4誘導(dǎo)的組蛋白瓜氨酸化是自殺性NETosis的關(guān)鍵。②細(xì)胞核DNA釋放式NETosis模式，此過程持續(xù)5～60 min，不伴有核或質(zhì)膜的破壞，且不依賴于活性氧的產(chǎn)生。NETosis發(fā)生后，中性粒細(xì)胞仍能夠吞噬病原體，且其壽命不會因為DNA損傷而受影響。③線粒體DNA被釋式NETosis， 此過程依賴活性氧的產(chǎn)生，中性粒細(xì)胞受到C5a或脂多糖刺激15 min內(nèi)80%會形成NETs[9]。

1.3NETS的檢測 NETs的檢測分為定性檢測和定量檢測，目前主要進(jìn)行定性檢測。佛波酯刺激中性粒細(xì)胞后，透射電子鏡下可觀察到細(xì)胞核和顆粒的崩解；也可用單克隆抗體標(biāo)記抗組蛋白-DNA復(fù)合物、MPO，或采用特殊染料二脒基苯基吲哚和SYBR Green對核酸進(jìn)行染色，在熒光共聚焦顯微鏡觀察到熒光現(xiàn)象可證實NETs的產(chǎn)生[11]。

有研究報道了一種靈敏度高且可自動化檢測NETs的定量方法，其采用Sytox green對人中性粒細(xì)胞的PKH26和胞外DNA進(jìn)行標(biāo)記，然后將細(xì)胞固定并使用三維共焦激光掃描顯微鏡成像，最后使用數(shù)字圖像分析量化NETs的釋放[12]。此外，還可應(yīng)用PicoGreen dsDNA Quantitation kit對血漿、血清中NETs的水平進(jìn)行定量檢測[13]。

1.4NETs的抗感染作用 中性粒細(xì)胞是感染早期發(fā)揮免疫效應(yīng)的主力細(xì)胞，被刺激后釋放的胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可捕捉病原體，同時也可幫助其他細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用，其上附著的大量抗菌蛋白可以殺滅病原體[3]。NETs經(jīng)脫氧核糖核酸酶Ⅰ(desoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ)處理會失去滅菌作用，因此DNA結(jié)構(gòu)對殺滅病原體有核心作用[10]。NETs包含的DNA和組蛋白具有內(nèi)在的抗微生物活性，DNA作為陽離子螯合劑，能夠破壞銅綠假單胞菌的外膜和內(nèi)膜[14]。組蛋白2A被認(rèn)為是最有效的抗微生物劑之一，特別是對大腸埃希菌、志賀菌屬、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等效果顯著。組蛋白的抗微生物作用不僅針對細(xì)菌，對寄生蟲同樣有效。NETs還可通過分解細(xì)胞因子和炎癥趨化因子減輕炎癥反應(yīng)，通過促凝血限制病原體擴(kuò)散[11,15]。長久的進(jìn)化壓力也使一些病原體產(chǎn)生了一些逃避NETs的機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，病原體可通過改變表面電荷躲避NETs的捕捉[16]。肺炎鏈球菌產(chǎn)生的毒力因子能夠降解NETs的DNA骨架，幫助肺炎鏈球菌從NETs上逃脫，促進(jìn)細(xì)菌從上呼吸道傳播到肺，然后向血液擴(kuò)散。

2 NETs與感染性疾病

2.1NETs與細(xì)菌感染 細(xì)菌、病毒、寄生蟲以及真菌都可以誘導(dǎo)炎癥過程，因細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物是第1個發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)NET形成的病原體，因此研究的較為深入。金黃色葡萄球菌是一種革蘭陽性菌，由于其具有逃避免疫系統(tǒng)、抵抗抗生素治療的能力而被稱為“超細(xì)菌”，能引起諸如骨髓炎、心內(nèi)膜炎、菌血癥等嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。在Brinkmann等[3]的試驗中，金黃色葡萄球菌首次被用作NETosis的刺激物。NETs可捕獲病原體，并阻礙其擴(kuò)散，發(fā)揮抗菌作用。在局部感染的早期階段或膿毒癥中，NETs的誘捕功能可能有助于膿腫的形成，并限制病原體傳播。一旦失去NETs的遏制，會導(dǎo)致疾病進(jìn)展。Thmmavongsa等[17]報道，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的NETs對巨噬細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用，可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；金黃色葡萄球菌還可以分泌毒性因子，逃避宿主免疫系統(tǒng)。因此，NETs與呼吸系統(tǒng)繼發(fā)感染導(dǎo)致的疾病進(jìn)展(如慢性阻塞性肺疾病、肺炎等)以及并發(fā)癥等相關(guān)[16]。

大腸埃希菌是一種革蘭陰性細(xì)菌，與很多疾病如腸炎、尿路感染、腦膜炎、敗血癥等的發(fā)病相關(guān)[18]。Czaikoski等[19]發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌引發(fā)的膿毒性休克患者的血清能刺激中性粒細(xì)胞，顯著誘導(dǎo)NETs的生成。Marin-Esteban等[20]研究嬰兒腹瀉時發(fā)現(xiàn)，NETs能夠捕獲、固定以及殺滅細(xì)菌，但當(dāng)中性粒細(xì)胞與上皮細(xì)胞系CaCo-2/TC7及細(xì)菌共同培養(yǎng)時，中性粒細(xì)胞能產(chǎn)生NETs，并損害上皮細(xì)胞。因此認(rèn)為NETs能夠損傷腸上皮，并與其他腸道炎性疾病相關(guān)。

2.2NETs與病毒感染 NETs在抗病毒反應(yīng)中的作用尚不清楚。最近的研究才開始闡明中性粒細(xì)胞參與宿主抗病毒反應(yīng)的效應(yīng)機(jī)制。盡管涉及抗病毒活性的幾個因子(包括MPO和α-防御素)在NETs中表達(dá)，但很少有研究描述NETs在病毒清除中的作用。Hoeksema等[21]報道，組蛋白對流感病毒感染具有保護(hù)作用，具體表現(xiàn)為富含精氨酸的組蛋白具有針對季節(jié)性H3N2和H1N1的強(qiáng)效抗病毒活性，可通過與病毒顆粒直接作用，進(jìn)而抑制病毒的攝取和復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)，人類免疫缺陷病毒顆粒被NETs捕獲后黏附在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，從而阻止病毒傳播，增加了NETs殺傷微生物組分的時間；此外人類免疫缺陷病毒誘導(dǎo)NETs生成的過程中，Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)8與TLR7的銜接誘導(dǎo)了活性氧的產(chǎn)生[22]。在呼吸道合胞病毒引起的下呼吸道嚴(yán)重疾病患者的支氣管肺泡灌洗液中也發(fā)現(xiàn)了NETs的存在，NET的形成可以防止呼吸道合胞病毒傳播，但卻無法殺死病毒；此外，呼吸道合胞病毒F蛋白也能通過TLR4誘導(dǎo)NETs，而這些NETs作為病毒儲存庫，其存在可能會加劇炎癥反應(yīng)，促進(jìn)氣道閉塞[23]?？傊?，NETs具有監(jiān)控病毒并阻止其擴(kuò)散以及感染靶細(xì)胞的作用。

2.3NETs與其他病原體感染 真菌也可以誘導(dǎo)NETs的生成。新型隱球菌是一種機(jī)會性致病真菌，可導(dǎo)致隱球菌病和腦膜腦炎。新型隱球菌的莢膜多糖賦予其調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)的能力，特別是能調(diào)節(jié)NETs的生成，莢膜酸性多糖通過抑制NETs的產(chǎn)生增強(qiáng)菌株的毒力[24]。弓形蟲是弓形體病的病原體，因攝入受污染的食物而致病。弓形蟲感染可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向感染部位募集。在鼻內(nèi)感染的小鼠模型中，中性粒細(xì)胞通過NETs捕獲和消滅病原體，并限制病原體的傳播[25]。

3 NETs與非感染性炎性疾病

3.1痛風(fēng) 痛風(fēng)是一種自身炎性疾病，其特征是關(guān)節(jié)中沉積的尿酸單鈉晶體吸引白細(xì)胞形成的痛風(fēng)石介導(dǎo)的組織損傷。尿酸單鈉晶體可以刺激中性粒細(xì)胞分泌IL-8、TNF-α以及IL-6，這些細(xì)胞因子不僅能促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集，還能誘導(dǎo)NETs形成。與其他疾病一樣，NETs可促進(jìn)痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)[26]；與其他疾病不同的是，NETs在終止痛風(fēng)發(fā)作中也具有重要作用。首先，NETosis預(yù)示了中性粒細(xì)胞的死亡，因此降低了中性粒細(xì)胞的密度；其次，NETs特有的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)封閉了尿酸單鈉晶體，保護(hù)其免受吞噬；最后，NETs衍生的蛋白酶可使細(xì)胞因子失活，并消除其促炎效應(yīng)[27]。

3.2RA RA是一種導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨損傷的持續(xù)性滑膜炎，也是一種全身性自身免疫性疾病。RA患者的滑膜液中浸潤了大量可以形成NETs的中性粒細(xì)胞，且RA患者外周血中中性粒細(xì)胞也較健康受試者更易產(chǎn)生NETs[28]。與其他自身免疫性疾病一樣，NETs也可能是細(xì)胞外自身抗原的來源,如在RA患者的滑膜中可檢測到組蛋白瓜氨酸化產(chǎn)生的瓜氨酸化肽在中性粒細(xì)胞的過表達(dá)。此類瓜氨酸化肽能被α-瓜氨酸肽抗體識別，形成誘導(dǎo)NETs形成的免疫復(fù)合物，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞顆粒以及胞質(zhì)自身抗原在關(guān)節(jié)的釋放[29]。中性粒細(xì)胞顆粒以及胞質(zhì)自身抗原也可釋放核因子κB配體和B細(xì)胞激活因子受體激活劑，分別激活破骨細(xì)胞和B細(xì)胞，在關(guān)節(jié)中誘導(dǎo)過度免疫反應(yīng)和組織損傷[30]。RA患者的血清中α-瓜氨酸肽抗體在疾病的早期階段，甚至在臨床癥狀出現(xiàn)前就能檢測到，是RA的早期生物標(biāo)志物。Khandpur等[28]發(fā)現(xiàn)，除NETs誘導(dǎo)的自身抗體外，IL-17和TNF-α也具有這種能力，并且這些細(xì)胞因子在RA患者的血清中過表達(dá)。

3.3系統(tǒng)性紅斑狼瘡 系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種自身免疫性炎性疾病，以漿樣樹突狀細(xì)胞的激活和自身抗體的產(chǎn)生為特征。NETs參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病理過程。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的體內(nèi)，來自NETosis和凋亡細(xì)胞的核酸物質(zhì)因清除失敗而沉積在患者體內(nèi)，這些自身抗原通過濾泡樹突狀細(xì)胞呈遞給次級淋巴器官生發(fā)中心的自體反應(yīng)性B細(xì)胞，產(chǎn)生針對NETs細(xì)胞成分的自身抗體[31]。產(chǎn)生的免疫復(fù)合物可通過Ⅱ型Fcγ受體介導(dǎo)的胞吞作用，通過TLR7和TLR9途徑激活漿樣樹突狀細(xì)胞分泌IFN-α，刺激更多的NETs產(chǎn)生，同時也可激活補(bǔ)體系統(tǒng)，并誘導(dǎo)炎癥、血管損傷以及血栓形成等[32]。研究證實，狼瘡性腎炎的進(jìn)展可能與體內(nèi)存在DNaseⅠ抑制劑以及與NETs結(jié)合的自身抗體，導(dǎo)致機(jī)體清除NETs的能力下降有關(guān)[33]。

3.4小血管炎 小血管炎是一種病因不明的全身性疾病，是影響小動脈、小靜脈以及毛細(xì)血管的炎癥[32]。在大部分小血管炎患者中可檢測到抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)，長期接觸NETosis釋放的蛋白質(zhì)如MPO、蛋白酶3、組蛋白等是產(chǎn)生ANCA的主要原因，這些蛋白可促進(jìn)炎癥介質(zhì)激活補(bǔ)體系統(tǒng)，并導(dǎo)致內(nèi)皮損傷。NETs中的MPO和蛋白酶3是ANCA的特異性靶抗原，這使免疫系統(tǒng)陷入一個惡性循環(huán)，使炎癥持續(xù)存在。另外，高水平的DNA-MPO復(fù)合物與疾病活動相關(guān)，α-蛋白酶3和α-MPO ANCA在疾病活動期間誘導(dǎo)NETosis，也可使免疫系統(tǒng)陷入惡性循環(huán)，加重小血管炎患者病情[33]。

3.51型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM) T1DM是一種自身免疫性疾病,先天免疫應(yīng)答細(xì)胞在其發(fā)病中起重要作用。在被炎癥細(xì)胞浸潤的胰腺中發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等能合成α干擾素和活性氧，進(jìn)而促進(jìn)促炎癥細(xì)胞因子的合成[34]。在糖尿病患者中，TNF-α升高激活中性粒細(xì)胞形成NETs，進(jìn)而釋放中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶以及蛋白酶3等細(xì)胞內(nèi)容物[34]。因此，T1DM患者血清中中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和蛋白酶3的水平和酶活性均升高，而它們在IFN-α、IL-1β、IL-18的成熟和釋放以及TLRs的表達(dá)和活化中均有重要作用[35]。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和蛋白酶3在T1DM發(fā)病中也起著重要作用，其能促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集到炎癥部位，形成負(fù)反饋，促進(jìn)自身免疫性糖尿病的發(fā)生。研究表明，T1DM患者和存在患病風(fēng)險的個體均患有中性粒細(xì)胞減少癥，其原因可能部分歸因于NETosis的增加和胰腺組織中中性粒細(xì)胞的浸潤[35]。炎癥急性期可抑制組織修復(fù)，因此NETs促進(jìn)炎癥和組織破壞的作用可以解釋其延緩糖尿病患者切口的愈合。NETosis需要葡萄糖提供能量，因此糖尿病患者的中性粒細(xì)胞更易釋放NETs，這可能與血糖升高對還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和線粒體的影響引起活性氧爆發(fā)有關(guān)，但更高的血糖水平會抑制NETosis[36]。

4 NETs與其他疾病

在子癇前期、血栓性疾病、腫瘤等多種疾病中均有NETs的生成。研究顯示,NETosis在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，因此推測DNaseⅠ治療可能對腫瘤有效[4,37]。在胰腺癌中也檢測到了NETs的存在，發(fā)現(xiàn)DNaseⅠ治療可減輕炎癥并抑制腫瘤生長[37]。血栓形成也與NETs相關(guān)，NETs中的核苷酸、酶類物質(zhì)均為促凝成分，組蛋白有助于血栓形成并促進(jìn)組織因子產(chǎn)生，同時激活凝血酶。在小鼠模型中已證實活化的血小板可刺激NETs生成，并引起深靜脈血栓形成[38]。在動脈粥樣硬化的早期炎癥階段，微小的膽固醇晶體可誘導(dǎo)NETs生成，斑塊中的巨噬細(xì)胞可促進(jìn)炎癥反應(yīng)并活化血小板，加重動脈斑塊病變引發(fā)的血管卒中事件[39]。近年來，在多種心血管疾病中已證實有NETs的生成，且其發(fā)生與炎癥反應(yīng)、血液高凝狀態(tài)有關(guān)[15]。對小鼠阿爾茨海默病模型的研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞的消耗或阻斷中性粒細(xì)胞募集可促進(jìn)阿爾茨海默病小鼠的病理學(xué)改善，同時改善認(rèn)知功能[40]。然而，NETs是否以及如何影響神經(jīng)元變性還有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié) 語

中性粒細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)中至關(guān)重要。隨著對中性粒細(xì)胞研究的進(jìn)一步深入，NETs作為中性粒細(xì)胞的一種新型抗菌方式，一直處于中性粒細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域的前沿。NETs不僅在炎性疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，同時也在眾多非感染性炎性疾病中擔(dān)任重要角色，但目前關(guān)于NETs的分子機(jī)制和信號通路仍不十分明確?？偨Y(jié)NETs在疾病中的作用有助于更好地理解NETs與一些疾病的關(guān)系，為疾病的預(yù)防和治療提供提新的思路。