靳 荷，鐘興武

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科,廣西 桂林 541002； 2.中山大學(xué)中山眼科中心角膜科，廣州510060)

角膜病是常見的致盲性眼病，僅次于世界第一致盲性眼病白內(nèi)障[1]。每年均有150萬(wàn)～200萬(wàn)新增角膜盲病例[2]。目前，仍有總數(shù)超1 000萬(wàn)例的雙眼角膜盲患者[2]。而角膜移植一直是很多角膜病變的最有效解決方法。同種異體的角膜移植手術(shù)在治療角膜盲上取得了一定進(jìn)展[3]。但近年來(lái)通過(guò)捐獻(xiàn)并能應(yīng)用于臨床的角膜材料越來(lái)越緊張，很難滿足患者的需求。每年全世界僅能實(shí)施10 000臺(tái)角膜移植手術(shù)，而其中一部分移植手術(shù)后患者會(huì)因移植排斥反應(yīng)和復(fù)雜炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致移植失敗[4]。

目前，各種人工生物材料和脫細(xì)胞生物材料的研發(fā)有助于在一定程度上緩解人類供體角膜的緊張情況。多項(xiàng)關(guān)于這些替代角膜材料的研究相繼被報(bào)道[5-7]。目前，大量關(guān)于豬眼角膜的移植實(shí)驗(yàn)研究在一定程度上取得了很多研究成果[8-10]?，F(xiàn)就異種材料在角膜組織中的應(yīng)用進(jìn)展及價(jià)值進(jìn)行綜述。

1 角膜概述

1.1角膜的解剖結(jié)構(gòu)及免疫特性 角膜組織在結(jié)構(gòu)分為上皮細(xì)胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層，角膜基質(zhì)內(nèi)的膠原結(jié)構(gòu)排列整齊，與角膜表面平行，平行排列的膠原結(jié)構(gòu)能對(duì)進(jìn)入眼的光線進(jìn)行折射，減少散射。同時(shí)，角膜內(nèi)皮細(xì)胞有“泵”的作用，通過(guò)Na+，K+-ATP酶活性維持房水和角膜Na+的梯度濃度，使角膜呈相對(duì)脫水狀態(tài)，是維持透明性的主要因素。同時(shí)，角膜組織沒(méi)有血管、淋巴等組織，使其在免疫反應(yīng)中享有免疫豁免特權(quán)，相對(duì)于肝、腎、心臟等器官的移植，發(fā)生組織排斥的概率大幅度降低[11-12]，是其能夠?qū)崿F(xiàn)異種移植的免疫基礎(chǔ)。供體植片經(jīng)過(guò)處理后，能在解剖上和功能上實(shí)現(xiàn)成功是異種移植成功的主要原因，其中解剖和功能上的因素包括組織構(gòu)建、角膜生物力學(xué)穩(wěn)定性、細(xì)胞行為學(xué)、屈光力等，同時(shí)，這些因素也應(yīng)與人類供體的相一致。目前，豬眼角膜被認(rèn)為是一種具備替代人供體的生物替代材料之一。

1.2異種角膜移植材料的相關(guān)處理方式 近年來(lái)，各國(guó)研究者正在努力研究探尋一種安全、高效的移植材料來(lái)緩解角膜供體的緊張情況，同時(shí)也能降低手術(shù)移植排斥反應(yīng)發(fā)生率。早在1987年McCarey等[13]研究采用氧化鉛玻璃植入手動(dòng)機(jī)械刀切開的角膜基質(zhì)層中，矯正無(wú)晶體眼所致的高度遠(yuǎn)視，但出現(xiàn)了角膜植片壞死及植片排出等嚴(yán)重并發(fā)癥。之后有研究者將聚甲基丙烯酸甲酯材料、水凝膠材料等人工合成材料植入角膜基質(zhì)中進(jìn)行觀察，但均有中毒性角膜基質(zhì)炎、植片排出、植片溶解等并發(fā)癥的報(bào)道[14-15]。人工合成材料的植片應(yīng)用于角膜移植還有待改進(jìn)，所以應(yīng)用異種的脫細(xì)胞生物材料作為供體植片進(jìn)行角膜移植開始受到關(guān)注。研究表明，脫細(xì)胞處理后的角膜材料可作為角膜組織再生的支架[16]。但有效通過(guò)化學(xué)或物理方法去除移植組織中的細(xì)胞成分，同時(shí)仍能保持組織的固有結(jié)構(gòu)是目前的一大難題[17]。目前有很多脫細(xì)胞方法，包括凍干法、射線法、化學(xué)法、物理法等[18]。凍干法是常用方法[19]，此方法減少了物理及化學(xué)損傷，也減少了角膜組織蛋白變性[20]，但對(duì)移植后受體角膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移生長(zhǎng)存在一定影響，術(shù)后的屈光矯正度數(shù)也存在一定問(wèn)題[18]。應(yīng)用化學(xué)法和物理法對(duì)角膜材料進(jìn)行脫細(xì)胞處理后可能會(huì)因柔韌性變差而導(dǎo)致植片不能進(jìn)行移植[21]。同時(shí)，此種脫細(xì)胞處理也可能會(huì)改變角膜基質(zhì)的微環(huán)境，從而導(dǎo)致移植失敗[22]。

對(duì)于通過(guò)射線照射脫細(xì)胞方法，研究證實(shí)γ射線照射后可以顯著降低角膜的免疫原性，疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)和植片被感染率[23]。雖然X線和γ射線的能量和發(fā)生機(jī)制不同，但兩者都是電磁波，均具備一定的組織穿透能力，在一定程度下均能引起組織內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生凋亡，所以生物學(xué)效應(yīng)相同[24]。因?yàn)棣蒙渚€源于放射性元素的衰變，γ射線對(duì)組織的破壞性更強(qiáng)，在空氣中傳播幾乎不受影響[25]，所以γ放射源的管理非常嚴(yán)格。而X線廣泛應(yīng)用于放療，使用更加安全、可控，來(lái)源也更方便。目前眼部X線的研究大多在于活體眼部腫瘤治療和對(duì)眼部正常組織保護(hù)性的研究[26]。因此，利用X線進(jìn)行離體角膜脫細(xì)胞處理是一個(gè)全新的研究領(lǐng)域。

角膜基質(zhì)主要由含細(xì)胞量相對(duì)較少的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。平行的膠原纖維(主要是Ⅰ、Ⅴ型膠原纖維，后者約占20%)組成了250～400個(gè)膠原小薄板，而兩個(gè)鄰近的膠原小薄板的膠原纖維幾乎垂直[27]。正常的角膜結(jié)構(gòu)和完整膠原排列組織是保持角膜透明性的必要條件[28]。當(dāng)角膜結(jié)構(gòu)不可逆的改變時(shí)，角膜的透明性也不會(huì)恢復(fù)[29-30]。目前很多研究在將異種植片處理后角膜的透明性均下降，然而X線或γ射線照射后發(fā)現(xiàn)角膜透明性無(wú)明顯改變，雖然在Masson染色中只能發(fā)現(xiàn)透鏡仍保持膠原結(jié)構(gòu)，但用電鏡觀察透鏡中超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)了膠原結(jié)構(gòu)的改變。雖然透鏡的膠原結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，變得稀疏，但并沒(méi)有影響透鏡的透明度，這也與Chae等[31]的研究結(jié)果相符，由于角膜基質(zhì)中小直徑的膠原纖維增加，增加了纖維間距從而保持角膜的透明性。Stevenson等[23]和Gotoh等[32]研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的射線可以減少胰島細(xì)胞的移植免疫排斥反應(yīng)，而γ射線照射能減少角膜植片的變異源。X線和γ射線均對(duì)組織具有一定的穿透力，均能誘導(dǎo)組織中細(xì)胞凋亡。γ射線由于強(qiáng)大的放射能，對(duì)放射源管理非常嚴(yán)格。而X線波長(zhǎng)較γ射線更長(zhǎng)，X射線更加安全、可控，來(lái)源及臨床應(yīng)用更廣泛。

1.3豬來(lái)源的異種角膜移植材料的限制因素 將異種脫細(xì)胞生物材料作為供體應(yīng)用于角膜移植面臨的主要難題是人類供體與異種供體角膜厚度的統(tǒng)一，這就導(dǎo)致手術(shù)中很難進(jìn)行邊緣的對(duì)齊與縫合，嫁接組織結(jié)構(gòu)厚度的不統(tǒng)一將導(dǎo)致移植失敗。人類角膜的中央厚度平均為536 μm[33]，而豬眼角膜的中央厚度達(dá)到了659～995 μm，且不同年齡段豬眼角膜厚度差距也較大[34]。豬眼角膜在經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理和保存后水腫程度大大增加，對(duì)于中央角膜厚度的測(cè)量也存在很大誤差。Choi等[8]將脫細(xì)胞處理后的豬眼角膜移植到非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物(恒河猴)中，移植后植片中央角膜厚度減少了400 μm。因此他們指出，保存后的豬眼角膜厚度若在850 μm左右，則比較適合進(jìn)行異種移植，能夠應(yīng)用于人類受體的異種移植研究，但目前對(duì)于超過(guò)950 μm的豬眼角膜還正在進(jìn)行相關(guān)的異種移植研究。

另一個(gè)異種角膜移植手術(shù)限制因素為角膜的生物力學(xué)。研究表明，豬眼角膜生物力學(xué)與人類非常接近，但柔韌性和黏性較人類低[35]。然而在非人類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，這樣的生物力學(xué)差距并沒(méi)有影響異種植片的存活率和長(zhǎng)期的生物力學(xué)穩(wěn)定性。豬眼角膜的屈光力為40 D，相較于人角膜的44 D可以作為接受異種移植的材料[35-36]。同時(shí)，豬眼角膜屈光力可以通過(guò)移植時(shí)調(diào)整植片大小與曲面弧度來(lái)增大屈光力，以達(dá)到接近人類供體的水平。

再者，角膜植片的透明性是視功能的重要需求，所以內(nèi)皮細(xì)胞的密度和功能必須與人類供體的相似。雖然豬眼角膜的內(nèi)皮細(xì)胞功能與人類的相似，具有“泵”的作用，使角膜呈相對(duì)脫水狀態(tài)，維持角膜的透明性，但豬眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度會(huì)隨年齡的增長(zhǎng)而降低，也存在同種異體的差異，所以在選擇植片供體前應(yīng)考慮豬的不同品種和年齡的差異[37]。

2 異種角膜移植的免疫學(xué)

具有良好的組織相容性的角膜供體植片是移植成功的基礎(chǔ)。雖然角膜是無(wú)血管、無(wú)淋巴管的組織，但在接觸到豬來(lái)源的抗原后仍會(huì)同時(shí)發(fā)生體液免疫和細(xì)胞免疫，從而誘導(dǎo)對(duì)異種來(lái)源的植片發(fā)生排斥反應(yīng)[38]。在豬眼角膜中，抗原的分布情況已被很多研究證實(shí)，在上皮細(xì)胞層、基質(zhì)層和內(nèi)皮細(xì)胞層中均有不同的高濃度抗原存在[39-40]。靈長(zhǎng)動(dòng)物的血清能夠結(jié)合這些異種的抗原，產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，引起排斥，特別是在上皮細(xì)胞層和富含膠原組織的基質(zhì)層這類反應(yīng)更加明顯。但目前研究表明，在內(nèi)皮細(xì)胞層沒(méi)有或僅有一小部分異種抗原能引起免疫反應(yīng)[40]。脫細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用使異種供體的抗原大幅度降低，從而降低了在活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中這種異種抗原帶來(lái)的嚴(yán)重免疫抗原抗體反應(yīng)[41]。目前，研究證實(shí)降低豬眼角膜中Gal和NeuGc兩種抗原的表達(dá)可以顯著降低人受體的抗原抗體反應(yīng)[42]。但完全抑制這兩種抗原的表達(dá)是否可以提高豬眼角膜植片的存活率仍是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。

在體外研究中，體液免疫和細(xì)胞免疫均能引起α1,3 -半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除來(lái)源的豬眼角膜中內(nèi)皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)，與野生型來(lái)源的豬眼角膜相比，加入人來(lái)源的CD46因子可以顯著降低α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除來(lái)源的豬眼角膜中的免疫反應(yīng)[42]。體外研究表明，來(lái)源于基因調(diào)控的豬眼角膜能夠減少T細(xì)胞對(duì)人受體的免疫反應(yīng)[6]。這些研究說(shuō)明，來(lái)源于α1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除/CD46的豬眼角膜可以在一定程度上減少靈長(zhǎng)類動(dòng)物異種移植的排斥免疫反應(yīng)。野生型來(lái)源的豬眼角膜能夠誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，特別是針對(duì)一些高風(fēng)險(xiǎn)移植的手術(shù)患者(炎癥期或者新生血管增殖期)，這兩種免疫反應(yīng)會(huì)更加強(qiáng)烈。因此，轉(zhuǎn)基因來(lái)源的豬眼角膜可能成為異種來(lái)源的角膜植片應(yīng)用于臨床。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的異種角膜移植研究表明，各種豬來(lái)源的異種角膜植片并不會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，同時(shí)，體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)均在異種植片排斥時(shí)發(fā)生[6,8,10]。

3 非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物異種角膜移植的動(dòng)物模型的研究

Kim等[6]和Choi等[8]依照供體豬的種類、受體的種屬、免疫抑制和角膜移植技術(shù)多方面進(jìn)行供體角膜生存率總體評(píng)估，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)處理的異種角膜供體(如脫細(xì)胞移植或脫水處理的植片)較新鮮的異種植片存活率更高。在應(yīng)用類固醇激素治療中，使用異種角膜植片，前板層角膜移植較穿透性角膜移植術(shù)植片存活率更高。目前，無(wú)論使用基因工程豬還是實(shí)驗(yàn)種屬豬來(lái)源的異種植片，在分別進(jìn)行前板層異種角膜移植術(shù)后，異種植片的存活時(shí)間均沒(méi)有超過(guò)120 d。然而，選用野生型來(lái)源的豬眼角膜進(jìn)行穿透性角膜移植，同時(shí)給予足夠的CD154抗體，可以達(dá)到超過(guò)6個(gè)月的植片存活率。總之，用新鮮的異種植片進(jìn)行角膜異種移植仍需要使用大量的免疫抑制和類固醇激素[42]。

除解決異種移植的植片應(yīng)用外，實(shí)現(xiàn)異種移植還有一個(gè)主要的障礙——手術(shù)方式的選擇。在鐘興武教授課題組的研究中，用小切口全飛秒激光輔助進(jìn)行異種植片的移植，將兔和人的新鮮植片進(jìn)行甘油凍存2周后，利用小切口全飛秒激光的輔助作用，做2 mm切口，將植片植入猴眼角膜的角膜層間[43]。在為期2年的觀察中，猴眼角膜植片保持透明，無(wú)植片溶解、植片脫出等現(xiàn)象發(fā)生[43]。這種手術(shù)方式利用飛秒激光輔助，可以在層間形成規(guī)則、可控、切削平面高度一致的層間切口，大幅度提高了手術(shù)效率。更重要的是，此種層間板層角膜移植手術(shù)方式使供體植片隔絕了角膜上皮淚液因子和內(nèi)皮細(xì)胞的影響，在一定程度上減少了受體組織因手術(shù)的炎癥反應(yīng)對(duì)植片的刺激，增大了植片的存活率。同時(shí)，植片的層間植入改變了受體角膜的體積和曲率，將角膜重新塑形，因?yàn)橹财那舛葦?shù)是可控的，所以這種增加性的屈光移植手術(shù)，不僅改變了角膜的體積還能改變整個(gè)眼前段的屈光狀態(tài)。該手術(shù)方式在單純移植方面，可以應(yīng)用于角膜溶解、角膜擴(kuò)張、圓錐角膜等基質(zhì)層加固性手術(shù)，在屈光方面，可以應(yīng)用于遠(yuǎn)視、老視等研究。所以，小切口全飛秒激光輔助進(jìn)行異種植片的移植這種手術(shù)方式是高效、預(yù)測(cè)性強(qiáng)、具有應(yīng)用前景的手術(shù)方式。

4 展 望

近年來(lái)，很多關(guān)于脫細(xì)胞豬眼角膜的應(yīng)用研究被相繼報(bào)道，其中，有進(jìn)行手術(shù)方式改進(jìn)后并成功降低異種植片免疫排斥反應(yīng)的報(bào)道，也有在豬眼角膜脫細(xì)胞處理方式上改進(jìn)后移植于人眼并移植成功的病例報(bào)道。在這些前驅(qū)研究的基礎(chǔ)上，關(guān)于豬眼角膜免疫工程學(xué)的研究及其相關(guān)法律、法規(guī)、倫理相繼進(jìn)行專家研討后，豬眼角膜在不遠(yuǎn)的將來(lái)可以在多方面應(yīng)用于臨床，也將大幅度緩解臨床供體緊張的現(xiàn)狀，造福于更多角膜病患者，降低角膜盲的發(fā)病率。