陳慧婧 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

禽流感（Avian Influenza，AI）是由禽流感病毒引起雞、火雞、鴨、鵪鶉和鵝及水禽、野鳥等患病的傳染性疾病，禽流感又被稱為真性雞瘟或歐洲雞瘟[1-2]。1978年，意大利首次報(bào)道了該病的出現(xiàn)[3]，直到1955年證明雞流感病毒含有甲型流感病毒的核蛋白，該病是由A型流感病毒引起[4]。感染禽流感病毒后，感染動(dòng)物臨床癥狀表現(xiàn)為：從無癥狀低致病力禽流感到中等致病力呼吸道癥狀，直至高致病性禽流感引起的烈性死亡[5-7]。因此，被國際獸醫(yī)局列為A類傳染病。

禽流感成為危害養(yǎng)殖業(yè)的首要疫病，并引起世界范圍的高度重視。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)在我國大部分禽群中流行的禽流感毒株主要是H9和H5亞型[8-9]。由于H9亞型屬于低致病率、低致死率的禽流感病毒，因此，養(yǎng)殖戶不夠重視，但該病毒可一直存在于禽群中，引起輕微呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋率下降，肉質(zhì)下降，H9亞型病毒的暴發(fā)依然給養(yǎng)禽業(yè)帶來不可估計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失[10-11]。疫苗免疫是預(yù)防禽流感的重要措施和有效途徑。為防止高致病性禽流感再次發(fā)生，我國采取了對(duì)家禽廣泛接種滅活疫苗等措施，收到了很好的效果[12-14]。由于生產(chǎn)中利用SPF雞胚培養(yǎng)病毒的成本高，而非免雞胚的培養(yǎng)也能獲取較純的病毒，同時(shí)價(jià)格較低，故本研究用H9亞型HP株接種非免雞胚，并對(duì)不同死亡時(shí)間段的尿囊液效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，以期探索該毒株在非免雞胚中的繁殖規(guī)律，得出雞胚的最佳培養(yǎng)時(shí)間和尿囊液收獲時(shí)間，最大限度提高單位體積尿囊液中的病毒含量，為制備高效疫苗提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 禽流感病毒（H9亞型HP株）種毒代次F2，批號(hào)DZ20140306，由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 非免雞胚，由揚(yáng)州康威提供，福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行孵化至10日齡。SPF雞胚，山東濟(jì)南斯帕法斯SPF雞場(chǎng)提供，由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行孵化至10日齡。

1.1.3 主要試劑 生理鹽水、1萬IU/mL青霉素鏈霉素溶液、1%雞紅細(xì)胞懸液，均由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 禽流感病毒繁殖

1.2.1.1 照蛋、畫蛋 非免疫蛋置于38～39℃、濕度50%～65%的孵化器內(nèi)孵化至10日齡，照蛋剔除無精蛋和死胚。在雞胚胎一側(cè)畫出氣室邊緣線，在大血管上方的氣室邊緣畫一個(gè)小圓圈，即為接種部位。

1.2.1.2 接種 取生產(chǎn)用禽流感種毒DZ20140306，用滅菌生理鹽水稀釋至10-4～10-5，并加青霉素、鏈霉素100～200 IU/mL。每胚尿囊腔內(nèi)接種0.1 mL稀釋好的種毒，共接種1 000枚非免雞胚，接種后密封針孔。

1.2.1.3 孵育、觀察與收獲 雞胚接種后，將1 000枚雞胚氣室向上置36～37℃、濕度為60%左右的溫室內(nèi)繼續(xù)孵化，使病毒在雞胚內(nèi)增殖，期間不必翻蛋。雞胚接種后，24 h照蛋一次，將24 h時(shí)照蛋死亡的雞胚棄去不用。之后需要每6 h照蛋一次，死亡雞胚隨時(shí)取出置于2～8℃冷庫保存，并記錄各時(shí)間段死亡雞胚數(shù)量；直至120 h，取出所有的胚，置于2～8℃冷卻12～24 h后，分別收獲各時(shí)間段（30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h、78 h、84 h、90 h、96 h、102 h、108 h、114 h、120 h）死亡雞胚尿囊液。

1.2.2 病毒含量測(cè)定

1.2.2.1 稀釋、接種 取9支滅菌試管，將試管依次編號(hào)為-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9，每管加生理鹽水9.0 mL。從被檢樣品中吸取1.0 mL加入第1管，混勻后從第1管中吸取1.0 mL加入第2管，同法依次做10倍系列稀釋至第9管。稀釋完成后按10-9、10-8、10-7稀釋滴度順序，每個(gè)稀釋滴度接種SPF雞胚（10日齡）5個(gè)，尿囊腔接種，每胚接種0.1 mL，接種完成后用石蠟封口，并置37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2.2 照蛋 SPF雞胚培養(yǎng)至24 h開始照蛋，之后每6 h照蛋1次，48 h以前死亡的雞胚棄去不計(jì)，培養(yǎng)至120 h。死亡雞胚取出，記錄死亡時(shí)間后置2～8℃冰箱保存。120 h后將剩余活胚取出，室溫放置15～30 min后再放入2～8℃冰箱。將48～120 h死亡的雞胚及活胚逐個(gè)收獲尿囊液，進(jìn)行血凝價(jià)測(cè)定。凝集價(jià)≥1：16（微量法）者判為感染，計(jì)算EID50。

2 結(jié) 果

雞胚接種禽流感種毒后，不同時(shí)間段死亡數(shù)量見表1，不同時(shí)間段死亡的雞胚尿囊液效價(jià)見表2。雞胚在60 h前死亡數(shù)量不多，在60～84 h每次照蛋死亡數(shù)量都超過了接種數(shù)量的10%，死亡比較集中在60～84 h。尿囊液效價(jià)隨著培養(yǎng)時(shí)間逐步升高，最開始24 h只有108.17EID50/mL，隨后病毒大量繁殖，在54～96 h效價(jià)達(dá)109.5EID50/mL及以上，最高時(shí)達(dá)109.63EID50/mL。

3 討 論

禽流感（H9亞型HP株）滅活疫苗的抗原生產(chǎn)主要原材料是雞胚，而雞胚又分為SPF雞胚、非免疫雞胚和普通雞胚。SPF雞胚無特定病原體，增殖病毒滴度高，但是成本較高，在滅活苗的大生產(chǎn)中使用SPF雞胚不太現(xiàn)實(shí)。而普通雞胚因?yàn)殡u群頻繁接種疫苗，使雞體內(nèi)有較高的抗體水平，所以，普通種蛋存在的母源抗體影響病毒的繁殖，在疫苗生產(chǎn)中也不可取。而非免疫雞胚的價(jià)格相對(duì)于SPF雞胚較為低廉，而且沒有接種病毒的母源抗體，對(duì)病毒繁殖影響不大，在滅活疫苗生產(chǎn)中使用廣泛。病毒含量高低直接影響疫苗的免疫效果，掌握最佳的培養(yǎng)及收獲時(shí)間，最大限度提高單位體積尿囊液中的病毒含量在疫苗生產(chǎn)中尤為重要。

本試驗(yàn)著重從禽流感病毒接種后雞胚死亡時(shí)間和不同死亡時(shí)間的病毒滴度兩個(gè)方面進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)感染后非免雞胚死亡數(shù)量占接種雞胚總數(shù)的80%以上。死亡雞胚尿囊液病毒檢測(cè)結(jié)果表明，禽流感H9亞型HP株接種非免雞胚后，雞胚死亡高峰期出現(xiàn)在60～84 h，該時(shí)段病毒的滴度也處于病毒繁殖的高峰期，最高達(dá)到109.63EID50/mL；直到96 h病毒仍維持較高的水平，為109.50EID50/mL，而96 h后病毒滴度開始衰減，所以，H9亞型HP株禽流感病毒最佳培養(yǎng)時(shí)間為96 h。

表1 不同時(shí)間段（非免）雞胚死亡數(shù)量

表2 不同死亡時(shí)間雞胚尿囊液病毒含量