李 敏，閆金玉，唐云飛，王 靜，杜東書，陳付學(xué)※

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院腦與心臟分子生物學(xué)實驗室，上海 200444；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實驗室，濟(jì)南 205101)

離子通道是成孔的跨膜蛋白，通過控制跨膜離子流調(diào)節(jié)生物體的生命活動，不僅參與細(xì)胞骨架的重塑和細(xì)胞之間的相互作用，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲性生長等過程[1]。K+通道在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性過程中具有重要作用[2]。人類基因組編碼40個電壓門控K+通道，參與多種生理過程，如參與神經(jīng)元和心臟動作電位的復(fù)極化、調(diào)節(jié)Ca2+信號和細(xì)胞體積、推動細(xì)胞增殖和遷移，電壓門控K+通道是自身免疫疾病、神經(jīng)和心血管疾病及惡性腫瘤治療藥物的開發(fā)研究熱點(diǎn)[3]。電壓門控K+通道的Ether-a-go-go(EAG)超家族由Eag、Elk、Erg 三個功能不同的基因家族組成，編碼各種低閾值K+電流，可在無脊椎動物和哺乳動物等生物體中的可興奮細(xì)胞廣泛表達(dá)[4-5]。激活EAG2電壓門控K+通道，可使K+流出細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)生命活動。EAG通道及各亞型通常通過突變作用于神經(jīng)元，引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，對維持正常生命活動具有重要作用。

惡性腫瘤的病死率極高。據(jù)統(tǒng)計，2010年美國確診惡性腫瘤患者1 529 560例，其中569 490例死亡[1]。離子通道參與惡性腫瘤的發(fā)生，腫瘤細(xì)胞可在低氧條件下無限增殖、遷移和存活。在細(xì)胞癌變過程中，某些惡性細(xì)胞Ca2+信號發(fā)生重塑，并通過抑制正常細(xì)胞增殖、逃避程序化細(xì)胞死亡、適應(yīng)缺氧環(huán)境、侵襲和擴(kuò)散到原發(fā)腫瘤部位，從而破壞正常生理功能[6]。離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和水通道蛋白可通過誘導(dǎo)細(xì)胞體積變化和調(diào)節(jié)Ca2+和H+信號促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[7]。在惡性腫瘤中，EAG電壓門控K+通道的異常表達(dá)可改變細(xì)胞周期的下游信號[8]。EAG通道可在多種器官腫瘤中表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖密切相關(guān)。Asher等[9]研究發(fā)現(xiàn)，EAG電壓門控K+通道調(diào)節(jié)劑是腫瘤發(fā)展的抑制劑，通過抑制EAG通道的表達(dá)可減少體外和體內(nèi)的腫瘤增殖。正常組織中，EAG通道呈限制性表達(dá)，故可能成為新的腫瘤標(biāo)志物?，F(xiàn)對EAG2在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 EAG2的結(jié)構(gòu)、生理特性和分布表達(dá)

1.1EAG2的結(jié)構(gòu)及電生理特征 EAG家族的結(jié)構(gòu)與其他電壓門控K+通道相同，由4個亞基以及位于胞內(nèi)的C端和N端組成，每個亞基由6個跨膜段(S1～S6)組成[10]。S1～S4是相對獨(dú)立的電壓傳感域，可將膜電位變化轉(zhuǎn)化為通道門控。K+選擇性透過孔位于S5～S6，門控電壓主要由S4結(jié)構(gòu)域內(nèi)兩個疏水殘基隔開的陽性精氨酸或賴氨酸殘基鏈作為電壓傳感器感測[11-12]。EAG2的N端保守結(jié)構(gòu)域由帶有端蓋結(jié)構(gòu)PAS結(jié)構(gòu)域組成，C端包含1個環(huán)核苷酸結(jié)合的同源結(jié)構(gòu)域。EAG2屬于EAG家族成員之一，與已知哺乳動物同源基因EAG1非常相似，故被稱為EAG2[13]。

EAG2和EAG1的氨基酸序列有70%的同源性[12]。相關(guān)研究表明，EAG2與EAG家族其他蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)相同，均具有6個跨膜結(jié)構(gòu)域，此外，EAG2還含有存在于S5～S6的特征孔(H5區(qū)域)，且不同EAG電壓門控K+通道成孔亞基中的特征孔(H5區(qū)域)高度保守，有助于形成通道K+選擇性透過孔[14]。EAG2通道的閉合通過鈣調(diào)素與通道 N端和C端的3個離散位點(diǎn)鈣調(diào)素依賴的結(jié)合實現(xiàn)，與電壓傳感器的激活無關(guān)[10]。

電壓門控EAG2通道含有環(huán)狀核苷酸結(jié)合同源結(jié)構(gòu)域和多種鈣調(diào)蛋白結(jié)合基序。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高可引起EAG2通道C端胞質(zhì)部分異源表達(dá)和原生EAG2通道的蛋白水解消化。Shimizu等[15]采用Ca2+載體A23187處理表達(dá)EAG2的細(xì)胞1 h發(fā)現(xiàn)，EAG2通道全長蛋白質(zhì)減少約80%，并伴有分子量30 000～35 000肽的出現(xiàn)；用Ca2+-ATP酶抑制劑毒胡蘿卜素處理3 h可去除EAG2通道蛋白質(zhì)中約1/3的分子量為30 000～35 000的肽。由于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加可導(dǎo)致EAG2通道蛋白水解，故Ca2+誘導(dǎo)的EAG2通道蛋白水解切割是EAG2通道蛋白的正常生理或病理反應(yīng)。

EAG2通道對生理pH變化的敏感性較高，EAG2易受細(xì)胞膜外質(zhì)子的抑制。細(xì)胞膜外的酸性環(huán)境可使EAG2通道的電導(dǎo)電壓曲線向去極化方向移動，導(dǎo)致電壓閾值下限降低，由此可見，EAG2通道對細(xì)胞膜外生理pH的變化高度敏感。EAG2通道的高pH敏感性有助于觀察體內(nèi)pH敏感的K+電流[4]。EAG2對細(xì)胞外Mg2+水平的變化敏感，當(dāng)細(xì)胞外Mg2+水平升高時，EAG2電導(dǎo)電壓的激活曲線降低[16]。當(dāng)細(xì)胞外無Mg2+時，EAG2對細(xì)胞外pH的變化更敏感。

Sch?nherr等[17]對比克隆人EAG(human EAG，hEAG)2與同工型hEAG1的研究發(fā)現(xiàn)，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，hEAG2激活的時間較hEAG1慢；對于hEAG2通道，亞基半最大激活所需電壓約為10 mV，但hEAG2激活對電壓的依賴性較小，電壓敏感性較低，故hEAG2通道可在較hEAG1電壓更低的電壓條件下開放。對hEAG2和hEAG1共表達(dá)及其產(chǎn)生電流的動力學(xué)分析表明，hEAG2和hEAG1可形成異源通道復(fù)合物。

1.2EAG2的分布表達(dá) Kcnh5編碼的EAG2(Kv10.2)蛋白主要在丘腦表達(dá)，在腦、睪丸、骨骼肌、心臟、胎盤、肺、肝臟亦有表達(dá)，在腎臟和胰腺的表達(dá)水平較低[18]。SD大鼠EAG2信使RNA主要在神經(jīng)組織中表達(dá)，在成人骨骼、心臟和平滑肌中未檢測到其表達(dá)。EAG2在腦中的分布與大鼠皮質(zhì)和嗅球內(nèi)EAG1的分布區(qū)域重疊，但其他部位的EAG2分布與EAG1存在差異，EAG2在小腦很少表達(dá)，但可在除紋狀體和腦垂體以外的大多數(shù)神經(jīng)組織表達(dá)，最主要的表達(dá)部位是丘腦、下丘腦和某些腦干核[19]。大鼠EAG2信使RNA在小腦、海馬、皮質(zhì)和髓質(zhì)少量表達(dá)，脾、肝、肺、腎、心臟、主動脈未檢測到其表達(dá)。

Jow和Jeng[20]通過免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色聯(lián)合激光掃描共聚焦顯微技術(shù)對視網(wǎng)膜EAG2表達(dá)的研究顯示，大鼠視網(wǎng)膜EAG1(rEAG1)和EAG2(rEAG2)的表達(dá)模式不同，視網(wǎng)膜內(nèi)叢狀層外半部分rEAG1免疫反應(yīng)最突出，而感光細(xì)胞、外叢狀層和內(nèi)核層外部和內(nèi)部段rEAG2的免疫反應(yīng)較強(qiáng)。由此可見，rEAG1和rEAG2 通道可能在視網(wǎng)膜神經(jīng)元電路的電信號傳輸中起重要作用。

Chuang等[21]對培養(yǎng)的幼齡海馬神經(jīng)元和成熟海馬神經(jīng)元的免疫熒光分析表明，樹突狀細(xì)胞和軸突區(qū)室中存在內(nèi)源性rEAG1和rEAG2電壓門控K+通道。海馬神經(jīng)元和視網(wǎng)膜樹突體細(xì)胞間的大鼠EAG1和EAG2通道的亞細(xì)胞定位不同[20]。rEAG1通道呈現(xiàn)點(diǎn)狀模式表達(dá)，與rEAG1相比，rEAG2 可能僅表達(dá)于培養(yǎng)7 d和12 d的體外神經(jīng)元軸突中，且表達(dá)水平較低，此外，rEAG2在幾乎所有神經(jīng)元樹突狀細(xì)胞或軸突均未顯示明顯的點(diǎn)狀分布[21]。

2 EAG2與惡性腫瘤

EAG2電壓門控K+通道主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，目前對EAG2電壓門控K+通道功能的研究較少。Yang等[22]的多態(tài)結(jié)構(gòu)模型研究發(fā)現(xiàn)，癲癇性腦病和具有自閉癥特征患兒的EAG2功能發(fā)生了獲得性突變。目前，尚無神經(jīng)系統(tǒng)與EAG2電壓門控K+通道功能實例的相關(guān)報道，EAG電壓門控K+通道突變導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)性能受損不僅與EAG通道功能障礙有關(guān)，還可能與腦發(fā)育期間EAG通道的特殊作用有關(guān)。EAG2電壓門控K+通道可持續(xù)影響神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用不容忽視。與EAG2可在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用相似，EAG2電壓門控K+通道可能對腫瘤細(xì)胞的增殖起重要作用。

腫瘤的發(fā)生過程與遺傳物質(zhì)的改變相關(guān)，遺傳物質(zhì)的改變可能導(dǎo)致正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞惡化可引起多種信號分子異常，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞獲得許多特定能力，如增殖不受控制、抵抗細(xì)胞凋亡。據(jù)報道電壓門控K+通道在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲中發(fā)揮不同的作用[23]。此外，腫瘤細(xì)胞中的電壓門控K+通道可通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[24]。EAG2電壓門控K+通道具有致癌性，不僅可參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，還可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖[25]。離子通道阻滯劑在體外通?？梢种茞盒阅[瘤細(xì)胞生長，如非特異性EAG電壓門控K+通道阻滯劑可誘導(dǎo)細(xì)胞膜去極化，從而影響黑色素瘤細(xì)胞系的增殖[26]。此外，細(xì)胞外K+濃度升高引起的膜去極化也以類似的方式抑制循環(huán)細(xì)胞的增殖[27]?，F(xiàn)對腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、胰腺癌與髓母細(xì)胞瘤中EAG2的異常表達(dá)予以闡述。

2.1EAG2與腎細(xì)胞癌 腎細(xì)胞癌是最常見的腎癌類型，占腎癌的90%～95%[28]。目前，全球腎癌的發(fā)病率每年增加約2%，男性與女性的發(fā)病比例約為1.5∶1，以60～70歲人群的發(fā)病率最高[29]。EAG1在大腦中廣泛表達(dá)，但在肝、肺、心臟和腎臟較少表達(dá)[30]。正常組織中EAG1的分布很少，惡性腫瘤細(xì)胞中EAG1的表達(dá)上調(diào)。已有研究證實，EAG1在多種腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)，其中包括腎細(xì)胞癌[31]。

與EAG1相同，EAG2也主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)。EAG2電壓門控K+通道在腎細(xì)胞癌中也呈過表達(dá)，Wadhwa等[24]比較腎細(xì)胞癌和正常腎組織中EAG和hEAG通道的研究發(fā)現(xiàn)，正常腎組織缺乏EAG2表達(dá)，而腎細(xì)胞癌中EAG2的表達(dá)明顯升高。可見，EAG2是腎細(xì)胞癌的潛在診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。

2.2EAG2與黑色素瘤 黑色素瘤是從含有黑色素的細(xì)胞中發(fā)展而來的癌癥，又稱惡性黑色素瘤。對黑色素瘤細(xì)胞功能特性的研究是制定抗腫瘤策略的重要前提。常利用電生理學(xué)和分子生物學(xué)方法表征人黑色素瘤細(xì)胞系的電壓門控K+通道，Meyer等[27]發(fā)現(xiàn)，所有黑素瘤細(xì)胞系均表達(dá)外向整流電壓門控K+通道，表明黑色素瘤中存在EAG1的表達(dá)，可見EAG電壓門控K+通道在黑色素瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要功能[32]。黑色素瘤細(xì)胞系的增殖可能受非特異性電壓門控K+通道阻滯劑(細(xì)格孢氮雜酸、奎尼丁)的影響[33]。

EAG2通道可在惡性腫瘤細(xì)胞系(包括黑色素瘤)以及正常成人腦和胎盤中表達(dá)。由于惡性腫瘤中EAG2電壓門控K+通道的表達(dá)存在異常，且轉(zhuǎn)錄活躍的基因通常與啟動子低甲基化和非活性啟動子的DNA過甲基化有關(guān)，故可對EAG2電壓門控K+通道基因啟動子的DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究。Kcnh5 參與腫瘤的細(xì)胞周期調(diào)控及增殖，其甲基化狀態(tài)異?？赡苁呛谏亓霭l(fā)生的標(biāo)志[23]。Macaulay 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，EAG2電壓門控K+通道的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因Kcnh5的甲基化程度較低，僅在人胎盤中表達(dá)。但可在黑色素瘤中檢測出來自胎盤特異性轉(zhuǎn)錄本的RNA[35]。因此，胎盤特異性Kcnh5 啟動子的低甲基化通常與黑素瘤細(xì)胞中Kcnh5 表達(dá)相關(guān)。

2.3EAG2與胰腺癌 胰腺細(xì)胞繁殖失控并形成腫塊，導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生。電壓門控K+通道對調(diào)節(jié)胰腺內(nèi)分泌和外分泌功能十分重要。在內(nèi)分泌胰腺中，許多電壓門控K+通道在胰島細(xì)胞中表達(dá)，并參與胰島素分泌；在外分泌胰腺中，腺泡細(xì)胞中電壓門控K+通道的主要作用是調(diào)節(jié)電解質(zhì)和酶的分泌。電壓門控K+通道可以決定細(xì)胞的靜息膜電位，并為胰腺和唾液腺等上皮細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和液體分泌提供動力[36]。電壓門控K+通道可調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性，參與上皮細(xì)胞的增殖、凋亡及離子轉(zhuǎn)運(yùn)，并對胰腺癌具有靶向治療作用(使用電壓門控K+通道開放劑以維持或上調(diào)胰腺分泌)。胰管中電壓門控K+通道可使膜電位超極化，并為陰離子分泌提供驅(qū)動力。胰管細(xì)胞功能性電壓門控K+通道的分子候選物包括Kcnn4 (KCa3.1)、Kcnma1 (KCa1.1)、Kcnq1 (Kv7.1)、Kcnh2 (Kv11.1)、Kcnh5 (Kv10.2)、Kcnt1 (KCa4.1)、Kcnt2 (KCa4.2)和Kcnk5 (K2P5.1)[12]。Kcnh5在嚙齒動物和人胰管細(xì)胞中清晰表達(dá)，但EAG2通道的生理或潛在病理生理作用尚不清楚。一些EAG2電壓門控K+通道被認(rèn)為是惡性腫瘤的標(biāo)志物，將特定電壓門控K+通道開放劑或抑制劑用于治療胰腺疾病仍需更深入的研究。

2.4EAG2與髓母細(xì)胞瘤 髓母細(xì)胞瘤是兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腦腫瘤，常沿腦和脊髓的軟腦膜轉(zhuǎn)移[37]。Huang和Jan[38]通過全基因組微陣列研究發(fā)現(xiàn)，不同分子和組織學(xué)亞群中EAG2的過表達(dá)是髓母細(xì)胞瘤的特征之一。對髓母細(xì)胞瘤的分子學(xué)和電生理學(xué)研究證實，髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中存在過量的EAG2蛋白，且EAG2過表達(dá)是人類髓母細(xì)胞瘤的重要特征[39]。EAG2表達(dá)水平下降不僅損害體外髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長，還可降低體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，并可提高其在異種移植研究中的存活率，表明EAG2電壓門控K+通道在促進(jìn)腦腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中具有進(jìn)化保守功能，進(jìn)一步說明靶向EAG2電壓門控K+通道在惡性腫瘤治療中的潛力[40]。下調(diào)EAG2表達(dá)可抑制髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的有絲分裂，增強(qiáng)p38促分裂原活化的蛋白激酶信號通路的活性，抑制腫瘤生長。與此相反，異位膜EAG2可導(dǎo)致髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞體積減小、細(xì)胞間期分裂樣形態(tài)細(xì)胞明顯減少，伴細(xì)胞周期異常，并可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞生長。由此可見，EAG2可能是重要的髓母細(xì)胞瘤治療藥物開發(fā)靶點(diǎn)。

3 小 結(jié)

EAG1和EAG2是EAG通道家族成員，在惡性腫瘤中呈過表達(dá)，可作為惡性腫瘤的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。EAG2電壓門控K+通道主要在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)。目前，對腫瘤中EAG2作用機(jī)制的相關(guān)研究較少。EAG2可在人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，特別對惡性腫瘤的研究具有重要作用，但具體機(jī)制尚不清楚。探索EAG2與人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系有助于加深對惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及診斷方法的認(rèn)識，為開發(fā)有效治療惡性腫瘤的藥物及方法提供理論支持。