黃 艷，劉志峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化科，南京 210008)

肝豆狀核變性又稱Wilson病，是一種以銅代謝障礙為特征的常染色體單基因隱性遺傳疾病，病變主要累及肝臟、腦、腎臟和角膜等部位，引起進行性加重的肝硬化、基底節(jié)損害、腎臟損害及角膜色素環(huán)等[1]。肝豆狀核變性由ATP7B基因突變引起，該基因編碼銅轉(zhuǎn)運P型ATP酶(copper-transporting P-type ATPase,ATP7B)。ATP7B是一種表達在多器官的膜蛋白，主要功能是促進銅隨血液及膽汁排泄。當(dāng)ATP7B基因發(fā)生突變時，ATP7B在細胞內(nèi)的定位發(fā)生改變，其轉(zhuǎn)運銅能力下降，引起血清銅藍蛋白合成減少、膽管排銅受阻。過量的銅蓄積在體內(nèi)，引起細胞壞死和器官損害，后期嚴重影響患者的生活質(zhì)量，最終可引起死亡。目前，肝豆狀核變性的診斷主要依靠典型的臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及基因檢測，治療包括青霉胺、鋅制劑和肝移植等。早期診斷和早期干預(yù)對于延緩疾病的進展和預(yù)防不可逆的后遺癥至關(guān)重要。目前，肝豆狀核變性的全球患病率大約為1/3萬，在隔離人群(如撒丁島)中，患病率可達1/1萬[2-3]，中國香港漢族患病率高達1/5 400[4]。目前對于ATP7B基因突變導(dǎo)致肝豆狀核變性的具體分子機制尚不完全清楚?，F(xiàn)就肝豆狀核變性ATP7B基因突變的研究進展進行綜述。

1 ATP7B分子結(jié)構(gòu)、定位及銅運輸功能

1.1ATP7B蛋白分子結(jié)構(gòu)ATP7B基因位于第13號染色體長臂(13q14.3～q21.1)，全長約85 kb，包含21個外顯子和20個內(nèi)含子，編碼一種由1 465個氨基酸組成的ATP7B。ATP7B屬于跨膜蛋白，含6個N端金屬結(jié)合域(N-terminal metal-binding domain,MBD)，每個金屬結(jié)合域都含一段高度保守重復(fù)序列蛋氨酸-X-半胱氨酸-X-X-半胱氨酸，8個跨膜通道(transmembrane domain,TM-區(qū))，1個ATP結(jié)合區(qū)(nucleotide-binding domain,N-區(qū))，1個磷酸化區(qū)(phosphorylation domain,P-區(qū))，1個磷酸酶區(qū)(phosphatase domain,A-區(qū))[5-6]。MBD與銅有高親和力，與抗氧化蛋白1(antioxidant-1,Atox-1)相互作用下接受來自細胞質(zhì)的銅離子，并促進銅釋放到跨膜孔道中[7]。MBD1～4主要調(diào)控其自身間的相互作用，MBD5～6是銅結(jié)合位點，能影響ATP7B蛋白的活性及催化能力[8]。半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序列位于第6跨膜通道，可選擇性通過金屬銅離子[6]。

如果ATP7B基因突變的殘基是與ATP或銅的結(jié)合的關(guān)鍵位點，可能會引起ATP7B功能的完全喪失；如果突變只是影響對底物的親和力、減緩構(gòu)象轉(zhuǎn)變或影響蛋白質(zhì)的定位，ATP7B可能保留部分轉(zhuǎn)運功能[9]。

1.2ATP7B定位及銅運輸功能 ATP7B是一種高度表達在肝細胞反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)的跨膜蛋白。銅主要在十二指腸吸收，通過高親和力銅轉(zhuǎn)運蛋白1參與肝腸循環(huán)。到達肝細胞后，銅和金屬分子伴侶Atox-1結(jié)合并形成復(fù)合物，然后與ATP7B以蛋白-蛋白的形式相互作用。銅在ATP7B作用下被轉(zhuǎn)運至反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)，并與相關(guān)的酶結(jié)合，形成血清銅藍蛋白，隨血液代謝；當(dāng)肝細胞內(nèi)的銅離子水平升高至一定程度時，ATP7B從反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運至溶酶體，將過量的銅運輸?shù)侥遗?，銅經(jīng)胞吐作用隨膽汁排泄[10]。在這一過程中，ATP7B借助ATP水解釋放的能量磷酸化，隨后脫磷酸化釋放銅跨膜所需的能量。因此，ATP7B依賴性膽汁銅排泄是維持銅代謝平衡的主要方式。

2ATP7B基因突變類型及特點

肝豆狀核變性ATP7B基因突變類型多樣，目前人類基因突變數(shù)據(jù)庫已收錄780種ATP7B基因突變，包括491種錯義/無義突變、65種剪切位點突變、187種小缺失/插入突變、12種大片段缺失。突變可能發(fā)生在基因的任何位置，包括外顯子、內(nèi)含子，甚至是啟動子區(qū)域。

ATP7B基因突變在不同種族和地域中存在遺傳異質(zhì)性。歐洲人群最常見的突變類型是14號外顯子上的H1069Q突變，在意大利、瑞典和羅馬尼亞等地多見，等位基因頻率為30%～70%[11-12]，臨床主要以錐體外系癥狀為主，如震顫、肌張力障礙、精神癥狀等。亞洲人群最常見的突變類型是8號外顯子上的錯義突變R778L，以中國、韓國和日本最多見，其等位基因頻率為17.3%～60%[4,13]，臨床以肝臟方面癥狀為主，如肝功能異常、肝硬化、肝脾大等；其余常見的還有P992L、Q1399R等。

不同區(qū)域發(fā)生突變的概率不同。①MBD區(qū)(與1～6號外顯子相關(guān))：目前已報道位于該區(qū)的錯義突變有18種，如位于MBD1的G85V，該突變抑制ATP7B與Atox-1的相互作用，影響蛋白和銅的結(jié)合[14]；②半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸跨膜轉(zhuǎn)運區(qū)(與7～10、12、13號外顯子相關(guān))：目前報道有103種突變，如R778L、G937S，該區(qū)突變主要通過改變蛋白的定位影響其功能[14]；③A-區(qū)(與11號外顯子相關(guān))：目前發(fā)現(xiàn)有22種突變，該區(qū)域突變可導(dǎo)致ATP7B超磷酸化，引起催化活性的喪失[14]；④P-區(qū)(與14～16號外顯子相關(guān))：有47種突變，如I1148T；⑤N-區(qū)(與17～18號外顯子相關(guān))：有超過55種突變，該區(qū)突變和P-區(qū)一起影響蛋白和ATP的結(jié)合，造成功能缺失[14-15]。但即使突變替換的氨基酸發(fā)生在同一區(qū)域，其編碼的蛋白功能改變也不完全相同。

3ATP7B基因突變的致病機制

目前，ATP7B基因突變功能研究以錯義突變?yōu)橹?，突變主要通過影響蛋白的合成、折疊、定位及降解等過程引起ATP7B蛋白轉(zhuǎn)運功能的減弱或缺失，最終引起銅的沉積。ATP7B基因突變可抑制法尼酯X受體/短異二聚體伴侶通路，引起膽汁酸生成增加，肝功能受損，導(dǎo)致膽汁淤積。銅代謝的主要途徑是膽汁，發(fā)生膽汁淤積時，進一步影響銅的代謝，從而引起惡性循環(huán)[16]。

3.1ATP7B基因突變影響mRNA轉(zhuǎn)錄 前體mRNA的選擇性剪接是真核生物增加蛋白質(zhì)多樣性的重要手段，對于基因表達非常重要，包括5′和3′端剪接等。剪接受順式作用元件和反式作用因子的調(diào)控，如剪接增強子、沉默子等。ATP7B基因中大約有10%的致病突變發(fā)生在外顯子和內(nèi)含子連接處的保守剪接位點。研究發(fā)現(xiàn)，肝豆狀核變性患兒攜帶ATP7B基因錯義突變R919G，該突變位于外顯子剪接調(diào)控元件區(qū)，引起外顯子跳躍及氨基酸改變[17]。體內(nèi)外實驗表明R919G出現(xiàn)外顯子跳躍，引起剪接增強子破壞、沉默子出現(xiàn)，從而影響外顯子12的剪接，引起蛋白功能的缺失[17]。因此，ATP7B基因點突變可能引起嚴重的mRNA異常剪接，而不是對編碼潛能的直接影響。

c.1707+5G>A突變位于5′剪接位點，影響前體mRNA的剪接。Liu等[18]利用剪接異常體外功能驗證實驗(minigene技術(shù))對該突變進行分析，發(fā)現(xiàn)c.1707+5G>A轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物出現(xiàn)外顯子4缺失，其擴增長度為293 bp，較野生型的457 bp明顯縮短；其mRNA表達水平較野生型明顯下降。外顯子4跳躍引起終止密碼子提前出現(xiàn)，導(dǎo)致ATP7B蛋白合成提前終止，銅離子通道失活。無義介導(dǎo)的mRNA降解途徑是真核細胞中重要的RNA監(jiān)控機制，可識別并降解開放閱讀框中含有提前終止密碼子的mRNA，消除異常的剪接形式，避免因截短的蛋白產(chǎn)物積累對細胞造成毒害。

3.2ATP7B基因突變導(dǎo)致ATP7B蛋白結(jié)構(gòu)改變 S653Y突變位點位于一段高度保守區(qū)域：G621-S668，在MBD6和TM1之間。該突變不會影響蛋白的定位及其折疊結(jié)構(gòu)，能正常運輸銅至反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)，不影響血清銅藍蛋白的形成；但當(dāng)細胞內(nèi)的銅水平升高至一定閾值時，ATP7B仍位于高爾基體內(nèi)，無法攜銅轉(zhuǎn)運至細胞膜。Braiterman等[19]研究發(fā)現(xiàn)S653Y突變引起跨膜段TM1內(nèi)的局部變形，導(dǎo)致跨膜區(qū)TM1和TM2的相互作用改變，從而影響ATP7B從反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運至溶酶體的過程。

突變位點在MBD4的G386V和G386D，與野生型相比，其蛋白結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性降低、活動性增強。在10 ℃以下時，大部分MBD4突變體蛋白很穩(wěn)定，即能正確折疊并且能結(jié)合銅，但G386V和G386D不能得到有效折疊。二級結(jié)構(gòu)分析顯示：G386V蛋白喪失部分α-螺旋，β-折疊含量增多；而G386D突變蛋白失去β-折疊結(jié)構(gòu)。與野生型相比，這兩種突變蛋白的結(jié)構(gòu)對稱性增強[20]。熱穩(wěn)定性研究表明，這兩種突變蛋白去折疊的熱溫度中點在40～50 ℃，較野生型的75 ℃明顯下降，提示其蛋白穩(wěn)定性降低[20]。MBD結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性直接或間接影響ATP7B各結(jié)構(gòu)域的相互聯(lián)系，進而影響ATP7B和Atox-1的作用，增加與COMMD-1的相互作用[20]。COMMD-1是一個負性調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性的因子，可以誘導(dǎo)ATP7B的降解及降低銅轉(zhuǎn)運活性。

3.3ATP7B基因突變引起ATP7B蛋白定位異常及表達量減少 ATP7B是定位于反式高爾基體的膜蛋白，主要利用水解ATP釋放的能量，將銅排出體外，維持體內(nèi)銅離子的平衡；突變型ATP7B可滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，無法攜銅轉(zhuǎn)運，引起銅在肝臟、腦等部位沉積。Huster等[9]對25種突變型ATP7B蛋白的銅轉(zhuǎn)運功能進行研究，發(fā)現(xiàn)其中大部分突變蛋白的銅轉(zhuǎn)運速率降低、承載銅離子數(shù)量減少；其中有16種突變蛋白的銅轉(zhuǎn)運能力僅有野生型的5%～10%，甚至更低，包括D1027A、H1069Q、P840L等；有8種突變保留部分轉(zhuǎn)運能力，如位于A-區(qū)的A874V、I857T；而只有M645R突變表現(xiàn)出銅過載現(xiàn)象。研究者將野生型及突變型ATP7B基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T和Sf9細胞，利用免疫熒光技術(shù)檢測ATP7B蛋白在細胞中的定位，結(jié)果顯示R969Q(突變位點在MBD區(qū))蛋白定位在反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)，與野生型一致；L1083F(突變位點在N-區(qū))和A874V(突變位點在A-區(qū))蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，定位改變；這三者突變型蛋白表達量較野生型均有明顯減少。Guttmann等[21]對L168P和S1423N研究發(fā)現(xiàn)前者蛋白表達量為野生型的(34.3±8)%，后者為(66.0±8)%。轉(zhuǎn)運實驗表明，L168P呈現(xiàn)出銅依賴性，S1423N則對銅水平升高無任何反應(yīng)。ATP7B突變蛋白的錯誤定位及表達量減少均可導(dǎo)致其轉(zhuǎn)運銅能力下降。

3.4ATP7B基因突變加快ATP7B蛋白的降解 由p38和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)介導(dǎo)的促分裂原活化的蛋白激酶信號通路可影響蛋白的穩(wěn)定性(如囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子[22])及調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑可保證正確折疊的蛋白質(zhì)輸出，對錯誤折疊的蛋白質(zhì)進行鑒別、分類和降解，以此清除細胞內(nèi)無功能的蛋白。Chesi等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在過表達H1069Q突變的細胞中，p38和JNK表達明顯升高。被激活的促分裂原活化的蛋白激酶信號通路誘導(dǎo)錯誤折疊的H1069Q蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑加快了突變蛋白的降解速度；同時由于細胞內(nèi)銅離子的蓄積，活性氧離子水平增加，進一步影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)環(huán)境，形成惡性循環(huán)。上述研究結(jié)果提示，p38和JNK抑制劑可以通過對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，糾正H1069Q、D765N、L776V和R778L突變型蛋白的錯誤定位，提高ATP7B蛋白在反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)的表達及其轉(zhuǎn)運能力；減少蛋白的降解，促進銅的代謝，降低細胞內(nèi)銅離子的水平；但對于A874V和L1083F突變沒有明顯糾正作用。

3.5分子伴侶類藥物可糾正突變型ATP7B蛋白的錯誤折疊 α晶狀體蛋白B鏈(α-crystallin B chain,CRYAB)是胞質(zhì)分子伴侶，屬于小熱激蛋白類，可以與跨膜蛋白結(jié)合，抑制多聚體復(fù)合物的形成，促進突變型蛋白正確折疊。研究顯示，CRYAB可以與ATP7B-H1069Q在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處相互作用，抑制突變蛋白中大段寡聚合物的形成[24]。免疫熒光結(jié)果提示，在與CRYAB共轉(zhuǎn)染下，超過60%的H1069Q蛋白恢復(fù)其正常定位。當(dāng)細胞內(nèi)銅水平升高時，CRYAB可以促進H1069Q重新分布于高爾基體囊泡，但對于H1069Q蛋白攜銅排出體外的能力無明顯提高。

姜黃素是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子ATP酶抑制劑，對膜定位有糾正作用。4-苯丁酸鈉可以通過幫助突變蛋白正確折疊，利用泛素-蛋白酶體途徑降解錯誤折疊蛋白，減少蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的沉積，并且通過穩(wěn)定蛋白構(gòu)象促進突變蛋白的轉(zhuǎn)運。van den Berghe等[25]報道，在30 ℃環(huán)境下或使用4-苯丁酸鈉和姜黃素干預(yù)，G85V、R778L和H1069Q等突變型蛋白的錯誤折疊可被部分糾正，引起膜蛋白表達增加，并隨藥物濃度升高而升高，其異常定位可被糾正。

4 小 結(jié)

肝豆狀核變性是一種常染色體隱性遺傳疾病，臨床表現(xiàn)多樣，受基因、年齡、飲食、脂質(zhì)代謝、種族等多種因素影響，給疾病的診斷和治療增加難度。ATP7B基因突變引起編碼蛋白錯誤折疊，導(dǎo)致ATP7B滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、其催化及轉(zhuǎn)運活性功能減弱或喪失，引起銅離子在肝臟、腦等部位沉積。關(guān)于銅介導(dǎo)的組織損傷機制目前仍不完全清晰。過量的銅蓄積在組織內(nèi)可能會引起一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和完整性，導(dǎo)致細胞損傷及凋亡。銅誘導(dǎo)的活性氧類水平增加和脂質(zhì)過氧化均可造成線粒體的損失[26]。同時，銅離子的積聚會引起肝細胞內(nèi)鋅的重新分布而損傷肝細胞[27]。

目前，肝豆狀核變性的治療包括藥物治療、手術(shù)治療、基因和細胞治療、康復(fù)治療等。在我國，由于D-青霉胺經(jīng)濟有效，是治療肝豆狀核變性的經(jīng)典藥物之一；但是對于有嚴重神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，特別是伴有肌肉僵硬的患者D-青霉胺不宜被使用[28-29]。研究顯示，某些分子伴侶類藥物(如4-苯丁酸)及p38和JNK抑制劑可以糾正突變蛋白的錯誤定位，恢復(fù)蛋白的轉(zhuǎn)運功能；小分子物質(zhì)DPM-1001能有效降低肝豆狀核變性小鼠模型中肝臟及腦部的銅水平[30]。個體化的細胞和(或)基因治療是目前的研究熱點，其根本目的是恢復(fù)ATP7B介導(dǎo)的肝膽管排泄銅的功能[31]，可能是未來最有前景的治療方法。