陳 萍 陳文娜

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院(遼寧 沈陽 110032)；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院(遼寧 沈陽 110032)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種慢性的血管炎癥，主要的病理改變是血管內(nèi)膜可見脂質(zhì)沉積，同時伴有單核細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的大量增生，單核細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后形成泡沫細(xì)胞，隨著脂質(zhì)的不斷沉積和結(jié)締組織的大量增生，脂點(diǎn)、條紋逐漸融合成片，向內(nèi)膜表面隆起形成粥樣斑塊，從而引起血管腔的狹窄。粥樣斑塊形成早期單核細(xì)胞遷移到血管內(nèi)皮下層，分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞在AS發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，可通過調(diào)控血管炎癥、脂質(zhì)沉積等影響動脈粥樣硬化的轉(zhuǎn)歸。

1 巨噬細(xì)胞的極化和可塑性

巨噬細(xì)胞的分型是根據(jù)其極化后所發(fā)揮的功能進(jìn)行命名的，即以分泌促炎因子為主、發(fā)揮促炎活性的為M1型巨噬細(xì)胞；分泌抗炎因子、發(fā)揮抗炎及組織修復(fù)作用的細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞[1]。干擾素-γ(interferon-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等可刺激巨噬細(xì)胞活化成為典型M1細(xì)胞。M1活化的標(biāo)志物有白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、TNF-α、IL-12、IL-23、CXCL9及CXCL10等。M1型巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生大量一氧化氮(NO)、活性氧等中間產(chǎn)物，參與腫瘤發(fā)生及抗寄生蟲感染的免疫過程。M2型巨噬細(xì)胞由IL-4，IL-10和糖皮質(zhì)激素刺激分化而成，Th2淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4與巨噬細(xì)胞表面的IL-4R結(jié)合，激活下游的JAK1、JAK3細(xì)胞信號通路，最后激活STAT6，表達(dá)M2型細(xì)胞相關(guān)蛋白[2]。M2型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生大量IL-10及少量IL-12，參與組織重塑、血管發(fā)生和腫瘤發(fā)展等過程，同時作為免疫調(diào)節(jié)劑參與過敏反應(yīng)。M2型巨噬細(xì)胞又分為4個亞型，分別為M2a，M2b，M2c，M2d。M2a的a代表“alternative”，M2a由IL-4、IL-13、免疫復(fù)合物、脂肪酸和Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)激動劑或IL-1R配體刺激分化而來，高表達(dá)甘露糖受體MR/CD206及FoxO1，分泌大量IL-10，其次是TNF-α，IL-6和IL-1。M2c型巨噬細(xì)胞由IL-10、TGF-β、糖皮質(zhì)激素等刺激產(chǎn)生，高表達(dá)Mer受體激酶(Mer receptor kinase，MerTK)[3]，并能分泌大量IL-10來抑制促炎細(xì)胞因子、NO、活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的產(chǎn)生，抑制炎癥發(fā)展。M2d型巨噬細(xì)胞由TLR激動劑刺激分化而來，TLR激動劑可刺激M2d型巨噬細(xì)胞上的腺嘌呤受體A2A受體。腺嘌呤信號通路可抑制TNF-α、IL-1和IFN-γ表達(dá)，并能促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和IL-10的表達(dá)，從而發(fā)揮促血管生成作用[4]。嚙齒動物的M2型巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物有FIZZ1(Found in inflammatory zone 1)、精氨酸酶(Arginase-1，Arg1)。其中M2d型巨噬細(xì)胞并不表達(dá)FIZZ1和MR。

2 巨噬細(xì)胞亞型與動脈粥樣硬化病變

體外實(shí)驗(yàn)中由于刺激單一，所以產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞亞型單一，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)情況復(fù)雜，斑塊中常常存在多個亞型的巨噬細(xì)胞，而且亞型的種類與其在斑塊中的位置有關(guān)。人的動脈粥樣硬化病變具有高度異質(zhì)性，即根據(jù)環(huán)境等多種因素可刺激生成多種巨噬細(xì)胞亞型。目前，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生不同亞型的機(jī)制及其在AS發(fā)生中的作用機(jī)制尚不明確。

研究顯示CD68+MR+的巨噬細(xì)胞主要存在于IL-4水平較高、脂質(zhì)水平較低的斑塊區(qū)域。Boyle等人發(fā)現(xiàn)了一種新的巨噬細(xì)胞亞型，稱為HA-mac。這種亞型巨噬細(xì)胞主要存在于粥樣斑塊的出血區(qū)域，高表達(dá)CD163，低表達(dá)人白細(xì)胞抗原DR。研究發(fā)現(xiàn)這種亞型的巨噬細(xì)胞具有抗動脈硬化的作用，其能清除血紅蛋白，減少氧化壓力。Mhem型巨噬細(xì)胞與HA-mac型巨噬細(xì)胞的功能相似，具有破壞紅細(xì)胞的作用[5]。這種巨噬細(xì)胞能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子1(Transcription factor 1)磷酸化激活。轉(zhuǎn)錄因子1可增加血紅素氧化酶(Heme oxygenase，HMOX-1)的表達(dá)，啟動肝X受體α(Liver X receptorα)/ABCA1/脂蛋白-E(Apolipoprotein，ApoE)級聯(lián)，從而起到抑制泡沫細(xì)胞形成的作用。粥樣斑塊中常常存在血管新生，導(dǎo)致紅細(xì)胞滲漏至斑塊中，從而增加斑塊中的鐵沉積。研究發(fā)現(xiàn)斑塊中鐵元素沉積部位往往聚集CD68+MR+型巨噬細(xì)胞，提示了M2型巨噬細(xì)胞在鐵離子循環(huán)中的作用[6]。

研究發(fā)現(xiàn)除了M1型、M2型和血紅蛋白相關(guān)的巨噬細(xì)胞亞型外，還存在嚙齒動物特異性的巨噬細(xì)胞，如Mox型巨噬細(xì)胞。Mox型巨噬細(xì)胞由斑塊中積累的被氧化的磷脂刺激而來。這種亞型高表達(dá)HMOX-1[7]。采用流式細(xì)胞技術(shù)對細(xì)胞分析結(jié)果顯示低密度脂蛋白受體(Low-Density Lipoprotein(LDL)Receptor，LDLR)敲除的小鼠斑塊中的巨噬細(xì)胞以M1型為主，占總巨噬細(xì)胞數(shù)的40%，其次是Mox型，占30%，M2型占20%，說明嚙齒動物特異性的巨噬細(xì)胞是粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞的重要組成部分。近來研究發(fā)現(xiàn)，人的粥樣斑塊中還存在M4型巨噬細(xì)胞，其能表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)7和鈣綁定蛋白S100A8。此外，M4型巨噬細(xì)胞還表達(dá)MMP12，MR，以及一些促炎因子如IL-6，TNF-α。雖然M4型巨噬細(xì)胞是受CXCL4刺激極化而來，但是M4型巨噬細(xì)胞并不表達(dá)傳統(tǒng)的CXCL4極化標(biāo)志物血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白清除受體CD163[8]。

3 巨噬細(xì)胞亞型與AS發(fā)生

3.1巨噬細(xì)胞亞型與炎癥相關(guān) 不同亞型巨噬細(xì)胞發(fā)揮不同的免疫效應(yīng)，有的為促炎癥作用，有的為抗炎癥作用，這些不同表型的巨噬細(xì)胞都參與到AS的發(fā)生發(fā)展中。研究發(fā)現(xiàn)20周齡的ApoE敲除的小鼠給予低能量飲食，斑塊病變中有巨噬細(xì)胞浸潤，而且以Arg+M2亞型的巨噬細(xì)胞為主，隨著疾病的發(fā)展M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型。與此同時斑塊中的細(xì)胞因子種類也發(fā)生變化，開始時以IL-4為主，隨著病情的進(jìn)展IFN-γ的表達(dá)增加，從而導(dǎo)致M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M1型巨噬細(xì)胞。Arg2+M1型巨噬細(xì)胞具有促炎癥作用，起到促進(jìn)斑塊形成的作用[9]。當(dāng)給予ApoE敲除小鼠髙脂飲食10周后，M-CSF高表達(dá)可刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)M2型標(biāo)志物，如selenoprotein-1，CD163等。GM-CSF刺激產(chǎn)生的M1型相關(guān)基因血小板堿性蛋白(Proplatelet basic protein，PPBP)主要在病變早期表達(dá)，隨著時間的延長，表達(dá)量降低。以上發(fā)現(xiàn)提示AS病變過程中GM-CSF和M-CSF的比例是改變的。以上說明小鼠AS病變中巨噬細(xì)胞的情況，因?yàn)樾∈缶奘杉?xì)胞亞型與人類有所不同，所以研究人員以人為研究對象，發(fā)現(xiàn)AS過程中斑塊中的M1和M2型巨噬細(xì)胞都顯著增加[10]。為了研究巨噬細(xì)胞亞型與斑塊的關(guān)系，研究人員比較了有癥狀的急性中風(fēng)患者和無癥狀的急性中風(fēng)患者的情況，結(jié)果顯示M1型巨噬細(xì)胞存在于有癥狀的患者的斑塊中，主要是不穩(wěn)定斑塊[11]。M1型巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)SR(Scavenger receptor)受體，這些受體可以介導(dǎo)細(xì)胞吞噬變性的脂蛋白如oxLDL。雖然M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎作用，但是它們在AS發(fā)生過程中的功能是不同的。M2a型巨噬細(xì)胞可抑制大量炎癥因子如INF-γ、IL-1[12]釋放，M2b和M2c主要起調(diào)節(jié)作用，能通過調(diào)節(jié)慢性炎癥相關(guān)的多種因素來抑制M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，從而限制損傷進(jìn)一步發(fā)展[13]。由于它們不合成細(xì)胞外基質(zhì)以及趨化因子受體，所以M2b和M2c型巨噬細(xì)胞不具有組織修復(fù)的能力[14]。

3.2巨噬細(xì)胞亞型與脂質(zhì)沉積相關(guān) M2型巨噬細(xì)胞由于表達(dá)CD36、SR-A1等能增加脂質(zhì)攝入的受體，所以易導(dǎo)致膽固醇的積累，過量積累的膽固醇激活LXR，導(dǎo)致ABCA1，ABCG1的大量表達(dá)，從而增加膽固醇的運(yùn)出。當(dāng)以上平衡被打破，如ABCA1，ABCG1表達(dá)缺失或活性降低，則導(dǎo)致脂質(zhì)在M2型巨噬細(xì)胞中積累。過度積累的脂質(zhì)將刺激M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換為M1型巨噬細(xì)胞，從而增加促炎因子分泌，促進(jìn)粥樣斑塊形成。

AS發(fā)病初期巨噬細(xì)胞大量攝取氧化低密度脂蛋白，減少膽固醇運(yùn)出，導(dǎo)致胞質(zhì)中大量脂化膽固醇沉積，從而形成泡沫細(xì)胞[15]。巨噬細(xì)胞通過SR如CD36、SR-A1、lectin樣oxLDL受體1(lectin-like oxLDL receptor-1，LOX-1)等攝取oxLDL。?；o酶A、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(Acyl coenzyme A：cholesterol acyltransferase-1，ACAT1)和中性膽固醇酯水解酶(Neutral cholesterl ester hydrolase，nCEH)參與膽固醇脂類的形成[16]。ATP結(jié)合槽轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCA1，ABCG1將膽固醇運(yùn)出巨噬細(xì)胞[17]。巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)，大量脂質(zhì)在細(xì)胞中積累，從而形成泡沫細(xì)胞。巨噬細(xì)胞中CD36，SR-A1，LOX-1介導(dǎo)脂質(zhì)吞噬，ACAT1、nCEH催化巨噬細(xì)胞中的脂質(zhì)形成膽固醇脂，ABCA1，ABCG1和SR-B1介導(dǎo)膽固醇運(yùn)出細(xì)胞。

4 巨噬細(xì)胞亞型對AS的調(diào)節(jié)機(jī)制

目前，研究已發(fā)現(xiàn)多種調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞亞型的機(jī)制，如MicroRNAs(miRNAs)、轉(zhuǎn)錄因子、高密度脂蛋白(high-denstiy lipoprotein，HDL)、雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)及雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian/mechanistic target ofRAPA，mTOR)等。

4.1miRNAs調(diào)節(jié) miRNAs是短的非編碼RNA，一般在22個核苷酸左右，這些核苷酸序列是高度保守的。mRNA通過RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，之后通過RNA酶Drosha和DGCR8形成miRNA前體。miRNA前體從細(xì)胞核進(jìn)入胞質(zhì)中，與胞質(zhì)中的RISC復(fù)合體結(jié)合，形成成熟的miRNA。成熟的miRNA與與目標(biāo)mRNAs結(jié)合，導(dǎo)致mRNAs降解或抑制其轉(zhuǎn)錄。miRNA在巨噬細(xì)胞分化和功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[34]。研究發(fā)現(xiàn)人和嚙齒動物的粥樣斑塊中都有miRNAs的表達(dá)[18,19]。其中研究最多最深入的是miR-155。研究發(fā)現(xiàn)miR-155在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。miR-155是一種由促炎作用的miRNAs，由TLR刺激表達(dá)，繼而增加促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。此外miR-155通過抑制B細(xì)胞淋巴瘤-6蛋白(B-cell lymphoma-6 protein，BCL6)表達(dá)來增加CCL2和TNF-α表達(dá)，從而促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞的活化[20]。miR-147是NF-κB信號通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，有抑制NF-κB信號通路的作用，可降低炎癥巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)。miR-21及miR-146a/b也具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞亞型的作用，通過降低促炎因子產(chǎn)生，增加抗炎因子IL-10水平來激活M2型巨噬細(xì)胞，從而抑制NF-κB信號通路活化[21]。Let-7e通過抑制TLR4信號通路來抑制M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，miR125b下調(diào)IFN調(diào)節(jié)因子4轉(zhuǎn)錄因子來減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞活化[22]。

4.2轉(zhuǎn)錄因子 大量研究發(fā)現(xiàn)核受體和轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞亞型上具有重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ具有增加M2型巨噬細(xì)胞的作用，PPARγ能增加M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物如MR、AMAC、IL-10的作用。體外實(shí)驗(yàn)中PPARγ在單核細(xì)胞分化初級階段起促進(jìn)極化的作用。小鼠實(shí)驗(yàn)表明PPARγ能促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)Arg1，而PPARα和PPARβ不能促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)[23]。Kruppel樣因子(Kruppel-like factor，KLF)4能增加Arg1表達(dá)，從而增加M2型巨噬細(xì)胞，其機(jī)制是通過抑制NFκB信號通路來減少促炎因子的表達(dá)，并激活STAT6信號通路來上調(diào)Arg1表達(dá)[24]。雖然KLF4和KLF6都能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞亞型，但是目前無明確結(jié)果證明這兩種轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)節(jié)粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞亞型。有研究發(fā)現(xiàn)LXRα能間接減少Arg1水平，從而抑制斑塊形成[25]。雖然M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎作用，但M2型巨噬細(xì)胞容易囤積過量脂質(zhì)。在人類巨噬細(xì)胞中，LXRα在CD68+MR+的巨噬細(xì)胞中低表達(dá)，這種巨噬細(xì)胞因?yàn)椴荒苁箖?nèi)吞的脂質(zhì)外流，所以容易引起脂質(zhì)的過量積累。研究發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)NR4R家族成員與巨噬細(xì)胞分型相關(guān)，但是缺少人類細(xì)胞結(jié)果[26]。此外，研究顯示Nur77表達(dá)缺失的小鼠體內(nèi)，巨噬細(xì)胞更易分化為具有促炎作用的M1型巨噬細(xì)胞。這是因?yàn)镹ur77缺失可以導(dǎo)致IL-12，iNOS水平降低，TNF-α水平增加。

4.3HDLs HDLs具有抗動脈粥樣硬化的作用，機(jī)制是HDL具有逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的作用。HDLs能將泡沫細(xì)胞的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)走，也能將膽固醇酯通過膽固醇至轉(zhuǎn)換蛋白形成富含甘油三酯的顆粒，從而形成乳糜粒殘余物和低密度脂蛋白。此外，HDLs還具有抗炎活性，如防止單核細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面等。

4.4RAPA和mTOR信號通路 RAPA是一種由放線菌鏈霉素產(chǎn)生的大環(huán)三烯類抗生素，具有免疫抑制的作用。RAPA能通過mTOR信號通路抑制T細(xì)胞增殖。mTOR是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及髓樣樹突細(xì)胞存活和增殖的重要調(diào)節(jié)因子。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都顯示RAPA能特異性導(dǎo)致M2型巨噬細(xì)胞死亡，而對M1型巨噬細(xì)胞無影響[27]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RAPA能通過增加CCR7，IL-6等M1型標(biāo)記物水平，減少M(fèi)2性標(biāo)記物如IL-10，CCL18，VEGF的表達(dá)來改變M1型和M2型巨噬細(xì)胞比例。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞具有高mTOR復(fù)合物(mTORC1)活性，mTORC1能通過調(diào)節(jié)Akt信號通路非依賴性PPARγ來抑制M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)[28]。當(dāng)加入mTOR抑制劑RAPA則能消除mTORC1的這種作用。目前，RAPA和mTOR在巨噬細(xì)胞分型上作用的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

動脈粥樣硬化的發(fā)病基礎(chǔ)主要有兩個，其一是膽固醇在血管壁中積累，其二是炎癥發(fā)生。膽固醇通過多種方式沉積于巨噬細(xì)胞，形成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞進(jìn)一步分泌多種促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)粥樣斑塊形成。巨噬細(xì)胞亞型與高脂血癥所致的動脈粥樣硬化的關(guān)系復(fù)雜，動脈粥樣硬化過程中多種因子參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞亞型，不同亞型巨噬細(xì)胞又通過不同機(jī)制如通過miRNA、轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控血管周圍的炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)沉積等，從而影響動脈粥樣硬化的轉(zhuǎn)歸。本研究對巨噬細(xì)胞亞型與動脈粥樣硬化的相互作用進(jìn)行深入探析，旨在揭示動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，從而為尋找更加有效的藥物防治動脈粥樣硬化性疾病提供新的思路。