樊 俊，譚 軍*，王 瑞，趙秀云，李 偉

1.湖北省煙草公司恩施州公司技術(shù)中心，湖北省恩施市市府路65號(hào) 445000

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢市洪山區(qū)獅子山街1號(hào) 430070

秸稈中含有農(nóng)作物生長(zhǎng)需要的多種營(yíng)養(yǎng)元素，可作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的肥料資源。但我國(guó)秸稈利用指數(shù)不高，秸稈還田率不足50%，且大部分被焚燒，對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染［1］。秸稈還田作為一種直接有效的利用方式，不但解決廢棄秸稈的環(huán)境污染問(wèn)題，也可以促進(jìn)農(nóng)村養(yǎng)分資源的循環(huán)利用和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展［2］。腐熟有機(jī)肥培肥土壤在中國(guó)有著悠久的歷史，是改良土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤肥力和增加作物產(chǎn)量的有效措施［3］。有機(jī)物料施入土壤能有效提高有機(jī)質(zhì)含量，在綜合改善土壤水、肥、氣、熱等方面具有較好生態(tài)效益［3-4］。土壤微生物和酶在土壤生態(tài)系統(tǒng)的有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)中起到重要作用，也是土壤環(huán)境質(zhì)量變化的敏感因子［5-6］，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量最重要的兩個(gè)生物學(xué)指標(biāo)［7-8］。因此，開(kāi)展秸稈還田和施用腐熟有機(jī)肥對(duì)土壤養(yǎng)分、酶活性和微生物多樣性的影響研究，能有效揭示有機(jī)物料施入后的土壤質(zhì)量變化，對(duì)完善土壤改良技術(shù)具有重要意義。

雖然有關(guān)秸稈還田及施用腐熟有機(jī)物培肥土壤方面的文獻(xiàn)報(bào)道較多［9-12］，但秸稈直接還田和施用腐熟有機(jī)肥對(duì)土壤養(yǎng)分提升和功能性微生物改善效應(yīng)，以及采用秸稈直接還田能否替代腐熟有機(jī)物改良土壤方面目前還沒(méi)有確切的定論。為此，進(jìn)行了水稻秸稈、玉米秸稈、煙草秸稈和腐熟有機(jī)肥還田的田間定點(diǎn)小區(qū)試驗(yàn)，探討秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)植煙土壤養(yǎng)分含量、酶活性、微生物數(shù)量及功能性微生物相對(duì)豐度的影響，旨在為提高當(dāng)?shù)赝寥郎a(chǎn)力和優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)水平提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)置在湖北省宣恩縣椒園鎮(zhèn)涼風(fēng)村（29°9772'N，109°3943'E）。海拔813 m，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)型山地氣候。年均氣溫13.7℃，無(wú)霜期263 d，年降水量1 635.3 mm，年日照時(shí)數(shù)1 212.4 h。試驗(yàn)田為長(zhǎng)年種植煙草的旱地，地勢(shì)平坦。供試土壤類型為黃棕壤，試驗(yàn)前耕層土壤（0～20 cm）pH 5.37，有機(jī)質(zhì)18.5 g/kg，堿解氮105.2 mg/kg，速效鉀223.3 mg/kg，有效磷18.3 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置3年的定位秸稈還田試驗(yàn)，時(shí)間為2015年2月—2017年9月。5個(gè)處理分別為：（1）水稻秸稈15 000 kg/hm2（RS）；（2）玉米秸稈15 000 kg/hm2（MS）；（3）煙草秸稈 15 000 kg/hm2（TS）；（4）腐熟煙稈有機(jī)肥 15 000 kg/hm2（TOF）；（5）對(duì)照，不翻壓秸稈（CK）。其中秸稈均為干質(zhì)量，用粉碎機(jī)粉碎至長(zhǎng)度5～10 cm。在煙株移栽前的整地過(guò)程中，將各處理的秸稈或有機(jī)肥均勻撒入各小區(qū)，采用旋耕機(jī)翻入0～20 cm深的耕層土壤中，再掏溝、施肥、起壟、覆膜、移栽煙株。每處理重復(fù)3次，小區(qū)面積為40 m2，種煙60株，隨機(jī)排列。試驗(yàn)田N∶P2O5∶K2O為1∶1.75∶3.05，各試驗(yàn)小區(qū)化肥施用量一致，為3.6 kg煙草專用復(fù)合肥（8∶12∶24），1.5 kg過(guò)磷酸鈣（0∶12∶0），0.45 kg硝酸鉀（13.5∶0∶44.5）。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

在連續(xù)還田處理第3年的煙葉采收完成后，每試驗(yàn)小區(qū)按“S”取樣法分別取0～20 cm壟體耕層土壤充分混勻，帶回室內(nèi)剔除植物殘?bào)w和其他雜物，一部分進(jìn)行土壤理化指標(biāo)［13］和酶活性［14］測(cè)定；另一部分保存于-80℃冰箱中，利用土壤DNA抽提試劑盒 Fast DNA?SPIN Kit for Soil（美國(guó)Qbiogene公司）提取土樣的總DNA，借助于16S rDNA和18S rDNA的通用引物對(duì)提取的土壤總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)序比對(duì)［15］，使用USEARCH方法，對(duì)各樣品的Effective Tags進(jìn)行聚類，將序列相似性達(dá)到97%的序列聚類生成操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）［16］。在煙葉移栽 60 d 后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法［17］進(jìn)行青枯病發(fā)病率調(diào)查，并計(jì)算病情指數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS 7.05和EXCEL 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。min-max標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)處理是對(duì)原始數(shù)據(jù)的線性變換，使結(jié)果值映射到［0，1］。

式中：x為標(biāo)準(zhǔn)化歸一后的值，X1為對(duì)應(yīng)的樣本數(shù)據(jù)值，Xmax為樣本數(shù)據(jù)的最大值，Xmin為樣本數(shù)據(jù)的最小值。

Shannon指數(shù)（H）是廣泛使用的物種多樣性指數(shù)之一，其值高則群落中各物種具有越大的均勻度，群落物種多樣性越高［18］。Chao1指數(shù)是對(duì)各樣品OTUs數(shù)目進(jìn)行計(jì)算，所計(jì)算Chao1結(jié)果值越大，表明微生物群落的豐富度越高［18］。

Shannon指數(shù)計(jì)算公式：

式中：ni為第i個(gè)微生物種類的個(gè)體數(shù)目，N為群落中所有微生物種類的個(gè)體總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)土壤養(yǎng)分的影響

表1表明，玉米秸稈、水稻秸稈和煙草秸稈還田處理的土壤堿解氮、速效磷、陽(yáng)離子交換量（CEC）較對(duì)照差異不明顯；土壤速效鉀含量為398.2～438.1 mg/kg、有機(jī)碳含量為11.33～12.31 g/kg、有效鋅含量為2.02～2.24 mg/kg、有效鎂含量為82.6～88.2 mg/kg、有效硼含量為0.343～0.400 mg/kg，分別較對(duì)照提高29.4%～42.4%、12.1%～19.4%、2.5%～13.7%、21.8%～30.1%和0～16.6%。有機(jī)肥還田處理的土壤速效磷、速效鉀、有效鋅、有效鎂、有效硼含量顯著高于其他秸稈直接還田處理和對(duì)照，表明秸稈腐熟還田對(duì)提高土壤養(yǎng)分的效果較直接還田更顯著。

表1 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)土壤養(yǎng)分的影響①Tab.1 Effects of straw returning and decomposed organic manure on soil nutrient contents

2.2 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)土壤酶活性的影響

土壤酶活性反映了土壤中各種生物化學(xué)過(guò)程的強(qiáng)度和方向［19］，有機(jī)肥物料的施入對(duì)土壤酶活性有重要影響（表2）。秸稈還田和腐熟有機(jī)肥處理后，土壤蔗糖酶和酸性磷酸酶的活性明顯增加，分別較對(duì)照處理提高了25.0%～129.5%和2.9%～25.1%；土壤脲酶活性有增加的趨勢(shì)，以水稻秸稈還田處理表現(xiàn)最好，較對(duì)照提高55.0%。水稻秸稈、玉米秸稈和煙草秸稈還田處理的土壤過(guò)氧化氫酶較對(duì)照降低4.9%～13.1%，有機(jī)肥還田處理對(duì)其影響不明顯。說(shuō)明秸稈還田處理對(duì)不同種類酶活性的影響不同，對(duì)土壤蔗糖酶、酸性磷酸酶活性和脲酶活性有提高的趨勢(shì)，對(duì)過(guò)氧化氫酶活性有降低趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)4種酶活性的min-max標(biāo)準(zhǔn)化加權(quán)值比較，有機(jī)肥還田處理對(duì)土壤酶活性影響綜合表現(xiàn)最好，其次為煙草秸稈和水稻秸稈還田處理，玉米秸稈還田處理的效果較差。

表2 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)土壤酶活性的影響Tab.2 Effects of straw returning and decomposed organic manure on soil enzyme activities

2.3 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性的影響

根據(jù)細(xì)菌16S rDNA和真菌18S rDNA鑒定出的種類數(shù)（OTUs）統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）可知，煙草秸稈還田的土壤真菌OTUs值最高，較對(duì)照提高55.6%，其次為玉米秸稈和有機(jī)肥還田處理；腐熟有機(jī)肥處理的土壤細(xì)菌OTUs值最高，較對(duì)照提高13.2%，其次為水稻秸稈還田處理。不同秸稈還田處理的土壤真菌Shannon指數(shù)在4.61～4.92之間，土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)在9.95～10.61之間，各處理間差異較小，以腐熟有機(jī)肥處理效果較好。煙草秸稈還田的土壤真菌Chao1指數(shù)最高，較對(duì)照增加20.8%，其次為玉米秸稈和有機(jī)肥還田處理；土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)最大的為玉米秸稈還田處理，較對(duì)照增加10.0%，其次為腐熟有機(jī)肥處理。綜合分析，秸稈還田土壤微生物OTUs總數(shù)量較對(duì)照提高7.4%～15.5%，說(shuō)明秸稈還田對(duì)提高土壤微生物數(shù)量效果明顯，最好的為腐熟有機(jī)肥處理，其次為玉米秸稈和水稻秸稈還田處理；秸稈還田對(duì)土壤微生物群落多樣性的影響效果不明顯，但對(duì)提高微生物群落的豐富度有明顯效果，以玉米秸稈和腐熟有機(jī)肥還田處理的效果較好。

表3 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)土壤微生物多樣性的影響Tab.3 Effects of straw returning and decomposed organic manure on soil microbial diversity

2.4 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)土壤功能性菌屬的影響

秸稈還田可降低植煙土壤硝化功能菌屬和反硝化細(xì)菌的相對(duì)豐度，降低幅度分別為10.1%～38.3%、26.5%～56.6%；但增加了土壤固氮菌屬微生物相對(duì)豐度，尤其是根瘤菌屬（Rhizobium）、短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium），固氮菌整體增加幅度為18.3%～52.0%，說(shuō)明秸稈直接還田可降低土壤微生物硝化反應(yīng)速率、反硝化反應(yīng)速率和增加土壤固氮菌微生物相對(duì)豐度，這可能更有利于土壤微生物固氮；而腐熟有機(jī)肥還田土壤固氮菌相對(duì)豐度降低，幅度達(dá)16.4%，這可能不利于土壤微生物氮的固定。秸稈還田植煙土壤煙草致病菌的相對(duì)豐度有降低的趨勢(shì)，尤其是玉米秸稈和煙草秸稈，但差異較??；腐熟有機(jī)肥處理土壤煙草致病菌的相對(duì)豐度較對(duì)照降低37.9%，表明秸稈腐熟后還田對(duì)降低煙草感病風(fēng)險(xiǎn)的效果優(yōu)于秸稈直接還田，見(jiàn)表4。

表4 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)特征菌屬相對(duì)豐度的影響Tab.4 Effects of straw returning and decomposed organic manure on relative abundance of functional bacteria （%）

2.5 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)煙草青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)的影響

圖1表明，移栽60 d后煙株青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)以腐熟有機(jī)肥處理最低，分別為11.81%和1.77，較對(duì)照降低73.8%和86.7%，明顯低于秸稈還田和對(duì)照；其次為秸稈還田處理，分別較對(duì)照處理降低46.1%～58.5%、65.9%～71.7%，效果達(dá)到顯著水平。表明連續(xù)3年施用有機(jī)物料能有效降低煙草青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)，而腐熟有機(jī)肥的防治效果優(yōu)于秸稈直接還田。

圖1 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)的影響Fig.1 Effects of straw returning and decomposed organic manure on incidence rate and disease index of tobacco bacterial wilt

3 討論

3.1 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)植煙土壤養(yǎng)分和酶活性的影響

土壤含量低的中微量元素通過(guò)施肥補(bǔ)充少，易出現(xiàn)虧損，導(dǎo)致作物生長(zhǎng)不良，嚴(yán)重的甚至造成大幅度減產(chǎn)［20］。作物秸稈中含有大量的氮、磷、鉀及中微量營(yíng)養(yǎng)元素，秸稈還田可以作為土壤養(yǎng)分元素缺乏的重要補(bǔ)充途徑。本試驗(yàn)中秸稈還田和腐熟有機(jī)肥處理的土壤中速效氮、鉀、鎂、硼等養(yǎng)分含量均有增加，說(shuō)明有機(jī)物料施入土壤可以在一定程度上彌補(bǔ)由于作物收獲而導(dǎo)致的農(nóng)田礦質(zhì)元素缺失，維持土壤養(yǎng)分的良性循環(huán)。同時(shí)，腐熟有機(jī)肥還田的肥效較秸稈還田更高，其原因一方面是煙稈經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理，養(yǎng)分釋放更加迅速和充分；另一方面可能是煙稈在腐熟發(fā)酵過(guò)程中，添加了一定量的高養(yǎng)分物質(zhì)以利于其更好發(fā)酵［21］，造成了腐熟煙稈有機(jī)肥養(yǎng)分含量較秸稈原料更高。

土壤酶活性受土壤微環(huán)境的影響，能有效反映土壤的質(zhì)量和健康狀況［12,19,22］，輕微的環(huán)境改變會(huì)使土壤中酶活性發(fā)生變化。本試驗(yàn)中秸稈還田和腐熟有機(jī)肥處理，土壤蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性與對(duì)照相比顯著增加，與前人的研究結(jié)果相似［23］，其原因可能是有機(jī)物料還田為微生物代謝提供更多可供分解的植物殘?bào)w［24］，進(jìn)而促進(jìn)了土壤酶的產(chǎn)生；另一方面，有機(jī)肥物料本身也帶入大量活的微生物，而土壤酶主要來(lái)自微生物和植物根系的分泌作用。另外，有機(jī)物料的加入導(dǎo)致土壤過(guò)氧化氫酶活性降低，與路怡青等［25］的研究結(jié)果不一致，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

3.2 秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)植煙土壤微生物的影響

秸稈還田能有效提高土壤微生物物種豐富度和群落多樣性，有利于土壤養(yǎng)分循環(huán)及肥力的提升，形成良好的土壤生態(tài)體系［26］。本研究表明，秸稈還田和腐熟有機(jī)肥對(duì)提高土壤微生物數(shù)量有明顯作用，對(duì)增加植煙土壤微生物群落豐富度也有一定效果，與前人的研究結(jié)果一致［27］。同時(shí)，秸稈直接還田能夠不同程度促進(jìn)或抑制土壤微生物種類數(shù)量變化，引起土壤功能性微生物菌群的改變，增加了土壤固定菌群相對(duì)豐度，可能更有利于土壤微生物對(duì)氮的固定；而腐熟有機(jī)肥降低了土壤固氮菌相對(duì)豐度，相對(duì)于秸稈直接還田，有機(jī)肥還田對(duì)土壤物理性狀、耕層土壤通透性的改善效果稍差［28］，不利于好氧性固氮微生物的生長(zhǎng)繁殖。

假單胞菌屬（Pseudomonas）、伯克霍爾德菌（Burkholderia）、勞爾氏菌屬（Ralstonia）和芽胞桿菌屬（Bacillus）等致病性細(xì)菌與煙草的野火病、細(xì)菌角斑病、黑斑病、青枯病和劍葉病等的發(fā)生密切相關(guān)［29］。煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的土傳病害，其發(fā)生不僅與高溫高濕的氣候有關(guān)，還與土壤種類、土壤養(yǎng)分、連作情況、移栽時(shí)期、中期管理等有關(guān)［30］。本研究表明秸稈直接還田對(duì)青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)的抑制效果好于對(duì)照，可能是由于秸稈還田通過(guò)改善土壤物理結(jié)構(gòu)和提高土壤養(yǎng)分水平使青枯病的發(fā)病率降低［31］。腐熟有機(jī)肥還田對(duì)土壤微生物的繁殖和群落結(jié)構(gòu)的改善效果最好［32-33］，對(duì)降低煙草感病風(fēng)險(xiǎn)的效果好于秸稈還田，與試驗(yàn)田青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)規(guī)律基本一致，說(shuō)明腐熟有機(jī)肥還田有利于降低煙草病害的發(fā)生率。其原因一方面是因?yàn)槭┯糜袡C(jī)肥料等措施能有效保持土壤養(yǎng)分平衡，增加土壤微生物多樣性，促進(jìn)有益微生物通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)減緩病原菌的繁殖速度［34］；另一方面腐熟有機(jī)肥還田能增加有益微生物的豐度如鏈霉菌（Streptomyces spp.）等［35］，有益微生物可通過(guò)產(chǎn)生多種活性物質(zhì)如抗生素等來(lái)抑制病原菌的繁殖，進(jìn)而抑制有害微生物的生長(zhǎng)從而達(dá)到防病的效果。

4 結(jié)論

秸稈還田和腐熟有機(jī)肥處理可有效增加植煙土壤養(yǎng)分含量，顯著提高土壤蔗糖酶活性、酸性磷酸酶活性和脲酶活性。以腐熟有機(jī)肥效果最好，其次為煙草秸稈和水稻秸稈處理。秸稈還田和腐熟有機(jī)肥處理可提高植煙土壤微生物OTUs數(shù)量和群落的豐富度，對(duì)微生物多樣性影響不明顯。秸稈直接還田增加了土壤固定菌群相對(duì)豐度，降低了硝化功能菌和反硝化功能菌的相對(duì)豐度，有增加土壤微生物固氮能力的趨勢(shì)；施用腐熟有機(jī)肥降低了固氮菌相對(duì)豐度，對(duì)致病菌的抑制效果優(yōu)于秸稈直接還田，更有利于降低煙草病害的發(fā)生率。