宋庭寧，洪宗國，曹 夕，朱薪穎，麻曉宇，袁 琳

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

1 引言

植物內(nèi)生菌(Endophyte)是部分階段或所有階段生活于健康植物的組織和器官內(nèi)部的細(xì)菌、真菌或放線菌[1]。植物內(nèi)生細(xì)菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的不可缺少的組成部分，它們長期生活在宿主植物體內(nèi)，與宿主植物相互提供所需要的營養(yǎng)，并通過自身新陳代謝或某些信號(hào)傳導(dǎo)的方式對(duì)植物生長產(chǎn)生作用，有利于加強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[2]。目前已證實(shí)植物內(nèi)生菌的作用主要有促生作用、產(chǎn)生活性成分(如抗腫瘤物質(zhì)、抗菌活性成分、抗病毒物質(zhì))、抗病蟲害作用、外源基因載體、降解環(huán)境污染物等[3]。由于植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生多種活性成分，在生物防治，醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力非常大，現(xiàn)已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[4]。植物內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)豐富，有較多的內(nèi)生菌資源沒有被發(fā)現(xiàn)，因此對(duì)植物內(nèi)生菌的研究具有良好的發(fā)展前景。 白英(SolanumlyratumThunb.)為茄科茄屬的植物，用于治療瘧疾、黃疽、水腫、淋病、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、膽囊炎、癌癥等[5]。巴天酸模(RumexpatientiaLinn.)為蓼科酸模屬植物，可涼血止血，清熱解毒，通便殺蟲[6]。葎草(Humulusscandens(Lour.) Merr.)是?？疲瑢俣嗄晟试荼局参?，具有清熱解毒，利尿通淋的作用[7]。澤漆(EuphorbiahelioscopiaL.)為大戟科草本植物，其地上部份具有利尿消腫，化痰散結(jié)，殺蟲止癢的功效[8]。商陸(PhytolaccaacinosaRoxb)為商陸科商陸屬多年生粗壯草本植物，根入藥，以白色肥大者為佳，紅根有劇毒，僅供外用，用于通二便，逐水、散結(jié)，治水腫、脹滿、腳氣、喉痹，外敷治癰腫瘡毒[9]。野老鸛草(GeraniumcarolinianumL.)為牻牛兒苗科老鸛草屬的植物，具有祛風(fēng)活血、清熱解毒等功能[10]。這6種植物分別采集于湖北省武漢市東湖馬鞍山森林公園、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獅子山、中南民族大學(xué)南湖邊。屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，并且3個(gè)地點(diǎn)都具有較為豐富的藥用植物資源，但不同的是馬鞍山森林公園植被較其他兩個(gè)地方濃密，并且植物生長環(huán)境較好，有森林和濕地兩大特色。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)與中南民族大學(xué)都依南湖而建，氣候相似，但華中農(nóng)業(yè)大學(xué)所采植物較中南民族大學(xué)而言環(huán)境較干凈，中南民族大學(xué)所采植物為南湖附近，屬于污染較為嚴(yán)重的地方。植物內(nèi)生菌受宿主植物、環(huán)境及季節(jié)等多因素的影響[11]。本文主要選取武漢市內(nèi)3個(gè)不同地方常見6種藥用植物，對(duì)不同植物、不同器官、不同采集地點(diǎn)的內(nèi)生菌多樣性進(jìn)行初步探討，對(duì)于尋找優(yōu)良內(nèi)生菌功能菌株有重要的指導(dǎo)意義，從而給新藥的研發(fā)提供了思路和參考。

2 實(shí)驗(yàn)材料

2.1 植物樣本采集

6種植物樣本分別采集于馬鞍山森林公園、中南民族大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獅子山，每個(gè)地方隨機(jī)采取2～3株健康生長的完整植株，裝入無菌自封袋，放入冰盒，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室 4 ℃保存，次日用于總DNA提取。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn))、分析天平(奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn))、NanoDrop One微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司生產(chǎn))、PD-FBI X線膠片觀察燈(廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司生產(chǎn))、PTC-100PCR擴(kuò)增儀(美國MJ Research公司生產(chǎn))、DYY-4C高壓雙穩(wěn)電泳儀(北京六一生物科技有限公司生產(chǎn))、DYCP-31D水平電泳槽(北京六一生物科技有限公司生產(chǎn))、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司生產(chǎn))、梯度凝膠電泳儀及TD331-AP1 型梯度膠電動(dòng)生成器(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

2.3 實(shí)驗(yàn)試劑及配置

CTAB提取液(2%CTAB，1mol/L Tris-Hcl pH8.0，1.4 mol/L NaCl，0.5 mol/L EDTA pH8.0，2%巰基乙醇)、高濃度CTAB溶液(10%CTAB， 0.7 mol/L NaCl)、苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)、TE緩沖液(10 mmol/L Tris-Hcl pH8.0，1 mmol/L EDTA pH 8.0)、5 mol/L NaCl、液氮、50×TAE(2.0 mmol/L Tris-醋酸，100.0mmol/L EDTA pH8.5)、1×TAE(Tris-醋酸-EDTA)、1×固定液(10%乙醇，0.5%冰醋酸)、染色液(0.2%AgNO3)、顯影液(1.5%NaOH，0.5%的37%甲醛)、10× Loading Buffer、0%的變性儲(chǔ)存液：20 mL 40%丙烯酰胺，2 mL 50×TAE，78 mL ddH2O。100%的變性儲(chǔ)存液∶20 mL 40%丙烯酰胺，2 mL 50×TAE，40 mL甲酰胺，42 g尿素，ddH2O補(bǔ)足100 mL。40%凝膠儲(chǔ)液(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=37.5∶1)、gel-red染色劑、瓊脂糖、DNA Maker 2000(大連TaKaRa公司生產(chǎn))。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 表面消毒

將植株的根和葉分開后，先用自來水清洗樣品表面，除去表面附著物，再用無菌水淋洗 3次，在無菌條件下晾干。

3.2 提取組織總DNA (改良的CTAB 法)

(1) 取樣品組織，用無菌剪刀剪成碎片后放入滅菌研缽中，加入液氮研磨成粉末。

(2) 取0.2 g 粉末至小管，加入65 ℃預(yù)熱的CTAB提取液1 mL，置于65 ℃水浴2 h；然后加入等體積氯仿∶異戊醇 ( 體積比為24 ∶1) 抽提，10000×g離心10 min。

(3) 取上清至另一EP管，加入1/10體積的高濃度CTAB溶液，65 ℃水浴1 h。

(4) 獲得DNA提取液加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇 (體積比為25 ∶ 24 ∶ 1) 抽提，

10000 ×g 離心10 min，取上清。

(5) 加入等體積氯仿∶異戊醇(體積比為 24 ∶1) 抽提，10 000 ×g 離心10 min，取上清。

(6) 加入1/2體積NaCl (5 mol/L) 和2倍體積分?jǐn)?shù)95%冰乙醇沉淀DNA，輕柔混勻，-20 ℃放置20 min。12000 ×g 離心20 min，棄上清。

(7) 用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌沉淀2次，待DNA干燥，加入30 μL TE緩沖液溶解DNA[12～14]。

3.3 DNA 質(zhì)量檢測

核酸蛋白測定儀測定純度和濃度：取上述方法提取的基因組 DNA， 采用核酸蛋白測定儀測定總 DNA 的濃度及計(jì)算A260/A280 比值。

3.4 16S rDNA的V3區(qū) PCR 擴(kuò)增

以提取的基因組DNA為模板，16S rDNA可變區(qū)V3區(qū)為靶標(biāo)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物：F357:(5’-CGCCC GCCGC GCCCC GCGCC CGGCC CGCCG CCCCC GCCCC CCTAC GGGAG GCAGC AG-3’)含GC夾子；下游引物：R518(5’-ATTAC CGCGG CTGCT GG-3’)[15]。PCR反應(yīng)體系為：總反應(yīng)體積為25 μL，其中包括Taq Mix 12.5 μL，引物各0.5 μL，模板1 μL，加雙蒸水dd H2O至25 μL 。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃變性45s、55 ℃退火75s、72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下成像，保存圖譜。

3.5 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

采用 TD331-AP1 型梯度膠電動(dòng)生成器進(jìn)行 DGGE 凝膠電泳。制備8%聚丙烯酰胺凝膠，變性劑線性梯度范圍為 35%～65%，1×TAE 緩沖液，先在150 V條件下預(yù)電泳 20 min，隨后在85 V條件下電泳14 h，電泳結(jié)束后，硝酸銀染色，用 Gel Doc XR + 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用Quantity one4.6.2軟件分析結(jié)果[16]。

4 結(jié)果

4.1 DNA質(zhì)量及PCR擴(kuò)增結(jié)果

各樣本基因組DNA的濃度在100～500 ng/μL之間，A260/A280 比值大約在1.8-2.1。將樣本DNA統(tǒng)一稀釋至40 ng/μL 濃度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖1所示，除了在中南民族大學(xué)采集的澤漆根樣本外，其余的在217bp左右位置均出現(xiàn)目的條帶。

圖中1、2、3代表樣本的采集地點(diǎn)，1號(hào)地是馬鞍山森林公園，2號(hào)地是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獅子山，3號(hào)地是中南民族大學(xué)。G代表根，Y代表葉

圖1 6種植物的內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA的V3區(qū)的擴(kuò)增結(jié)果

4.2 DGGE電泳圖譜

DGGE電泳圖譜如圖2所示，處于不同位置的每條 DNA帶可能代表微生物群落中某一特定微生物種，其相對(duì)亮度代表其在群落中的相對(duì)豐度[17]，各個(gè)泳道條帶多少和顏色深淺代表了各個(gè)植物內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量和含量的差異，也反映了各個(gè)植物內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性的差異。從圖2中可以看出，各個(gè)泳道的條帶已經(jīng)分開，優(yōu)勢特征條帶明顯，條帶A是白英的的優(yōu)勢特征條帶，條帶B和I是巴天酸模的優(yōu)勢特征條帶，條帶C是葎草的特征優(yōu)勢條帶，條帶D是澤漆的特征優(yōu)勢條帶，條帶G是商陸的特征優(yōu)勢條帶，條帶E、F、H是野老鸛草的特征優(yōu)勢條帶，每種植物優(yōu)勢條帶的數(shù)量和位置均不相同。但同種植物不同器官間比較，條帶1是巴天酸模的根特有的，條帶2、3是澤漆的葉特有的，條帶4、5所代表的菌落在商陸的葉中的含量比根中多，條帶6所代表的菌落在野老鸛草的根里面的含量比葉中多，葎草中根的菌落豐富度大于葉。圖2說明了不同植物間，內(nèi)生菌群落種類有差異，但多樣性差別不明顯；每種植物不同器官、不同地點(diǎn)橫向比較，發(fā)現(xiàn)同株植物不同器官中根的內(nèi)生菌群落比葉多，但不同地點(diǎn)的內(nèi)生菌群落條帶位置及亮度相似度較高，可能與三地相鄰較近有關(guān)，周圍環(huán)境對(duì)植物內(nèi)生菌群落影響不明顯。

圖中1、2、3代表樣本的采集地點(diǎn)，1號(hào)地是武漢馬鞍山森林公園、2號(hào)地是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獅子山、3號(hào)地是中南民族大學(xué)

圖2 6種植物不同地點(diǎn)不同器官內(nèi)生細(xì)菌的DGGE圖

4.3 聚類分析圖

采用Quantity One 4.6.2軟件的UPGMA算法進(jìn)行聚類分析，以反映6種植物內(nèi)生細(xì)菌的物種類型和豐度在總體水平上相似度的差異。結(jié)果如圖3所示，其中，同種植物聚在一起，各成一簇，白英和野老鸛草，澤漆和巴天酸模，葎草和商陸又聚在一起組成3大簇，說明白英和野老鸛草，澤漆和巴天酸模，葎草和商陸的內(nèi)生細(xì)菌相似度較高。同種植物相同器官不同地方的也能大致聚在一起，說明不同器官的植物內(nèi)生菌有差異，而不同地方的差異不大。

其中澤漆的根和商陸1號(hào)地的根3個(gè)樣本單獨(dú)成一簇，說明澤漆的根和葉內(nèi)生細(xì)菌差別很大，也可能是樣本差異造成的。

4.4 多樣性分析

采用QuantityOne軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行菌落相似性和多樣性分析。結(jié)果如表1，其中豐富度(S)、均勻度(EH)和多樣性指數(shù)即Shannon 指數(shù)(H)等指標(biāo)用來描述與比較各個(gè)樣品的內(nèi)生細(xì)菌多樣性[18]。計(jì)算公式如下。

H=—∑Pi·lnPi

(1)

EH=H/Hmax=H/lnS

(2)

式(1)、(2)中Pi是樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品中所有條帶強(qiáng)度的比率。S為豐富度，即樣品每一泳帶的條帶數(shù)目。S值越大，說明物種多樣性越高。H值越大，說明群落多樣性越高。

各樣本的豐富度、均勻度和多樣性指數(shù)結(jié)果見表1。由表1可見，白英的根和葉中內(nèi)生菌多樣性無明顯差異，巴天酸模、葎草和野老鸛草根中內(nèi)生菌的豐富度明顯大于葉，說明這3種植物根的內(nèi)生菌物種多樣性大于葉。澤漆葉中內(nèi)生菌的豐富度和多樣性均明顯大于葉，說明澤漆葉的內(nèi)生菌物種多樣性和群落多樣性均高于根。而不同地點(diǎn)的同種植物之間差別并不明顯。

表1 6種植物的內(nèi)生細(xì)菌DGGE圖譜多樣性指數(shù)分析

續(xù)表1

樣本多樣性指數(shù)H用ⅹ± s表示豐富度S用ⅹ± s表示均勻度Eh用ⅹ± s表示3-葎-Y1.92100.831-澤-G1.661.79±0.1967±1.410.930.93±0.002-澤-G1.9280.931-澤-Y2.732.65±0.121717.33±0.580.960.93±0.042-澤-Y2.71180.943-澤-Y2.51170.891-商-G2.622.79±0.261820.33±4.930.910.93±0.022-商-G3.09260.953-商-G2.67170.941-商-Y2.942.97±0.052222.33±0.580.950.95±0.012-商-Y2.95220.953-商-Y3.02230.961-野-G2.913.06±0.3232226±10.580.940.95±0.022-野-G2.83180.983-野-G3.43380.941-野-Y3.053.02±0.042423.67±2.520.960.96±0.022-野-Y3.03260.933-野-Y2.98210.98

5 討論

植物本身有其獨(dú)特的微生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)于藥用植物而言，不同植株，不同產(chǎn)地，其藥用價(jià)值不同，其中的微生物群落對(duì)藥材的有效成分有著重要的影響，而影響植物生長的因素有很多，如地理位置、氣候條件、光照、水分等，因此這些條件又間接影響植物的內(nèi)生菌群落多樣性，使得不同產(chǎn)地藥材的有效成分產(chǎn)生差異。

本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)采取武漢3個(gè)不同地點(diǎn)6種常見植物，并對(duì)其根和莖的內(nèi)生細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了初步調(diào)查。研究發(fā)現(xiàn)同一地點(diǎn)的不同植物之間內(nèi)生細(xì)菌種類與數(shù)量均存在較明顯差異，每種植物都有其優(yōu)勢特征條帶；同一地點(diǎn)的同一植物的葉與根的內(nèi)生細(xì)菌種類存在較大差異，菌落數(shù)量也存在差異。相同植物不同地點(diǎn)的內(nèi)生細(xì)菌群落(無論是葉，還是根)種類無明顯差異，但存在菌落數(shù)量上的差異，這可能是由于3個(gè)采樣的地點(diǎn)處于同一市區(qū)，氣候環(huán)境相近所致。

現(xiàn)如今微生物領(lǐng)域的研究越來越得到人們的重視，隨著科技的進(jìn)步，未來對(duì)于植物內(nèi)生菌的有效利用必不可少，人們可以明確分析出對(duì)藥用植物有效成分起促進(jìn)作用的植物內(nèi)生菌并加以利用，對(duì)當(dāng)?shù)厮幉牡漠a(chǎn)量、質(zhì)量都有進(jìn)一步改善[19]，在藥用植物學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的前景。