王麗輝，張永欣

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300300）

雞傳染性鼻炎是由副雞禽桿菌引起的一種急性上呼吸道傳染病，臨床癥狀主要以感染后腫頭、流鼻涕及鼻竇發(fā)炎為特征，引起蛋雞產(chǎn)蛋率下降及育成雞和肉雞生長(zhǎng)不良和淘汰率增加，嚴(yán)重影響雞只的生產(chǎn)性能[1-4]。副雞禽桿菌的易感日齡主要分為育成階段和產(chǎn)蛋階段，7～18周齡感染后主要引起雞只生長(zhǎng)不良，在產(chǎn)蛋階段感染后會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降30%～50%，給養(yǎng)雞業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，該病由于傳播快，易于造成混合感染，而受到當(dāng)前規(guī)?；⒓s化養(yǎng)禽業(yè)的普遍重視[5]。根據(jù)美國(guó)學(xué)者Page1962年的分類方法，將副雞禽桿菌分為A、B、C 3個(gè)血清型，不同血清型之間免疫關(guān)系相距較遠(yuǎn)，B型菌的免疫保護(hù)具有一定的型特異性[6-7]。

本試驗(yàn)自重慶某雞場(chǎng)的部分發(fā)病雞中，經(jīng)臨床診斷為雞傳染性鼻炎，對(duì)病雞的眶下竇進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和PCR診斷，確診為雞傳染性鼻炎。我國(guó)于1986年首次在北京分離到副雞禽桿菌，而后陸續(xù)在不同省、市、區(qū)分離到副雞禽桿菌，經(jīng)鑒定均為Page A型；Page C型副雞禽桿菌在我國(guó)曾有過報(bào)道，但分離菌株并沒有保存下來；2003年張培君等從遼寧某雞場(chǎng)分離到1株B型副雞禽桿菌，這是我國(guó)首次報(bào)道的由Page B型引起的雞傳染性鼻炎[8-12]。雞傳染性鼻炎在我國(guó)不同地區(qū)均有發(fā)生，流行毒株也有地域差異，不同地區(qū)報(bào)道的疾病的發(fā)生，對(duì)當(dāng)?shù)氐募膊》揽鼐哂兄卮蟮囊饬x[13-14]。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料來源

病雞來源于重慶某雞場(chǎng)，病雞表現(xiàn)為腫頭、眼角有淚痂、流涕，精神不振，不喜食，具有雞傳染性鼻炎的典型癥狀。

1.2 試劑

含輔酶I的雞肉湯瓊脂平板、全血平板、革蘭氏染色液等，均為自制；dNTP、PCR bufer、Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL1000、均購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；其他試劑，均為分析純。

1.3 PBS

稱 取 NaCl 6.0 g、 Na2HPO41.757 g、NaH2PO40.709 g，溶于1 000 mL水中，溶解后用10%NaOH調(diào)pH至6.9～7.1，121℃高壓滅菌15 min，室溫保存，備用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基配制

雞肉湯的制備：取雞胸脯肉泥1份加純化水2份，在2～8℃浸泡過夜，煮沸30 min，除去肉渣，澄清過濾。

雞肉湯培養(yǎng)基的制備：取多聚蛋白胨5 g、酪蛋白氨基酸5 g、氯化鈉5 g和雞肉湯100 mL，加入純化水至1 000 mL，調(diào)pH至7.4。經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌15 min并冷卻至40℃以下，加入終濃度2%滅活的雞血清和10 μg·mL-1NAD用于細(xì)菌培養(yǎng)。

雞肉湯瓊脂培養(yǎng)基的制備：稱取多聚蛋白胨1 g、酪蛋白氨基酸1 g和NaCl 1 g，用200 mL雞肉湯溶解后，使用10%氫氧化鈉調(diào)pH至7.3～7.4，然后加瓊脂3.6 g使其完全溶解。經(jīng)121℃高壓滅菌15 min，取出后降溫至約60℃，加入10 mL雞血清和終濃度10 μg·mL-1NAD，混勻后制備培養(yǎng)平板或斜面?zhèn)溆谩?/p>

2.2 發(fā)病情況

2018年，來源于重慶某雞場(chǎng)100～130日齡商品育成雞發(fā)生多起以頭部腫脹、流淚為主要臨床癥狀的病例，病初僅有少數(shù)雞群發(fā)病，幾天后就迅速蔓延至所有雞群，個(gè)別雞只出現(xiàn)死亡，嚴(yán)重影響雞的生長(zhǎng)發(fā)育，給雞場(chǎng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

將疑似雞傳染性鼻炎癥狀的病雞頭，用無菌手術(shù)刀片切開眶下竇，用棉拭子沾取眶下竇內(nèi)容物，接種于血平板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察菌落。若出現(xiàn)疑似的單個(gè)菌落，進(jìn)行純化培養(yǎng)。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)特征；同時(shí)在含NAD的雞血清雞肉湯瓊脂平板上劃線，挑取單個(gè)可疑菌落接種到含血清的雞肉湯中進(jìn)行純培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行下一步的鑒定。

2.4 形態(tài)特征

參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 538-2002雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)方法，對(duì)可疑病料進(jìn)行副雞禽桿菌的分離。用棉拭子在無NAD的雞血清雞肉湯瓊脂上劃5～7條橫線，然后再用產(chǎn)NAD表皮葡萄球菌劃一豎線，翻轉(zhuǎn)平皿置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～20 h，觀察疑似菌落是否出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象，并挑取典型菌落進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)。

2.5 PCR鑒定

2.5.1 PCR菌落樣品制備

挑取平皿上的可疑菌落，加到含10 μL水的0.2 mL小離心管中，壓緊管蓋，95℃加熱10 min，再冰浴10 min后進(jìn)行PCR擴(kuò)增或-20℃保存。

2.5.2 PCR陰陽性對(duì)照樣品制備

用10μL水作為陰性對(duì)照樣品，用9 μL水加1 μL已知陽性對(duì)照物作為陽性對(duì)照樣品。95℃10 min，再冰浴10 min后進(jìn)行PCR擴(kuò)增或置-20℃保存。

2.5.3 引物設(shè)計(jì)

參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 538-2002雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)方法根據(jù)16srRNA設(shè)計(jì)鑒定副雞禽桿菌鑒定引物，擴(kuò)增全長(zhǎng)為527 bp。上游為5'-TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT-3'，下游為5'-CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT-3'。

2.5.4 PCR擴(kuò)增

參照NY/T 538-2002雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)方法，將樣品管5 000 r·min-1離心5 min，吸上清做DNA模版，配制25 μL反應(yīng)體系。再瞬時(shí)離心，置PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃10 min；94℃30 s，65℃30 s，72℃ 1 min，循環(huán)34次，72℃延伸10 min。

2.5.5 瓊脂糖凝膠電泳

待PCR反應(yīng)結(jié)束后，每個(gè)PCR樣品取5 μL于含0.5 μg·mL-1EB的2.0%瓊脂糖凝膠孔中電泳，同時(shí)加入5 μL的1 000 bp的Mark作為參照，在120 V恒壓電泳中20 min，取凝膠置紫外成像儀觀察。

2.5.6 結(jié)果判定與表示方法

陽性對(duì)照樣品應(yīng)在500 bp附近呈現(xiàn)一條目的條帶，陰性對(duì)照樣品無條帶。被檢樣品若出現(xiàn)與陽性對(duì)照同樣大小的一條目的條帶，則判為陽性，記作“+”，若無條帶，則判為陰性，記為“-”。

2.6 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)

挑取將可疑菌落，接種到含血清的雞肉湯中進(jìn)行純培養(yǎng)，搖床160 r·min-1，培養(yǎng)18 h，取新鮮的雞肉湯培養(yǎng)物0.5 mL，眶下竇接種30日齡SPF雞5只，接種后逐日進(jìn)行10日臨床觀察，并記錄結(jié)果。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 發(fā)病情況

病雞主要表現(xiàn)為眼瞼腫脹、鼻道和鼻竇有粘液性分泌物流出等上呼吸道癥狀。發(fā)病初病雞精神沉郁，垂頭縮頸，鼻孔流出稀薄水樣鼻液，3～5 d后轉(zhuǎn)變?yōu)轲ひ盒苑置谖?。眼結(jié)膜發(fā)炎，流淚，一側(cè)或兩側(cè)眼眶周圍組織水腫，發(fā)病后，雞群采食量明顯下降。

3.2 細(xì)菌分離情況

病雞眶下竇內(nèi)分泌物在雞血清雞肉湯瓊脂平板上為露滴狀菌落，在普通肉湯和普通瓊脂平板上不生長(zhǎng)，挑取菌落圖片，革蘭氏染色鏡檢可見為兩級(jí)濃染的陰性短桿狀，在輔酶Ⅰ的肉湯瓊脂上和全血平板上生長(zhǎng)灰白色、邊緣整齊、表面光滑、有輕度隆起、黏液狀、濕潤(rùn)、有光澤、不透明的菌落。

3.3 衛(wèi)星現(xiàn)象

分離物在接種有表皮葡萄球菌的雞血清雞肉湯瓊脂平板上呈現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”，即越靠近葡萄球菌的周圍其生長(zhǎng)越好，且過氧化氫酶陰性，初步判定為疑似副雞禽桿菌疑似菌落。

3.4 PCR鑒定

根據(jù)上述生化鑒定結(jié)果，用針對(duì)副雞禽桿菌16sRNA設(shè)計(jì)的引物，對(duì)該菌進(jìn)行PCR鑒定，可得到大小為0.5 kb的片段，與陽性樣品一致，而陰性樣品中無該片段的條帶。通過PCR方法檢測(cè)，驗(yàn)證其為副雞禽桿菌，結(jié)果見附圖。

3.5 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)

取可疑菌落制備成菌懸液，取0.2 mL接種30日齡SPF雞眶下竇，接種雞在8 h后即可見到流鼻涕，腫頭等典型的鼻炎癥狀，臨床觀察記錄結(jié)果見附表。接種48 h后，所有雞均開始出現(xiàn)典型的鼻炎癥狀即攻毒一側(cè)眶下竇及周圍腫脹，鼻部有鼻涕或結(jié)痂，在攻毒第3～5天最為嚴(yán)重，隨后不再有新發(fā)病例出現(xiàn)，在9 d后所有病例逐漸好轉(zhuǎn)。

附圖 PCR鑒定結(jié)果

附表 SPF雞攻毒結(jié)果

4 治療和預(yù)防

4.1 治療

對(duì)發(fā)病雞只進(jìn)行隔離治療，使用消毒劑進(jìn)行帶雞消毒，連續(xù)消毒5 d，土霉素按使用說明書2～3倍量飲水治療。未發(fā)病的雞群，緊急接種雞傳染性鼻炎疫苗。

4.2 預(yù)防

4.2.1 疫苗接種

科學(xué)的預(yù)防接種免疫，是防治本病的關(guān)鍵措施，可根據(jù)近年來雞場(chǎng)附近的流行毒株選用適用的疫苗，進(jìn)行科學(xué)的免疫程序。雞傳染性鼻炎有A、B、C 3個(gè)血清型，不同血清型之間的無交叉免疫保護(hù)，因此在免疫時(shí)應(yīng)考慮使用A、B、C型三價(jià)疫苗來進(jìn)行免疫，通常在4～6周齡免疫1次，間隔10周，進(jìn)行第2次免疫。

4.2.2 科學(xué)的飼養(yǎng)管理

加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高飼養(yǎng)條件，有通風(fēng)保障，調(diào)控飼養(yǎng)密度適應(yīng)飼養(yǎng)周期；一旦發(fā)病，立即隔離治療發(fā)病雞，對(duì)未發(fā)病雞進(jìn)行帶雞消毒；對(duì)曾發(fā)本病的雞舍，進(jìn)雛前應(yīng)進(jìn)行徹底的清洗和消毒，并應(yīng)空舍1～2周，再重新進(jìn)雞；本病易與大腸桿菌等病混合感染可引起病雞死亡，病程較長(zhǎng)，反復(fù)發(fā)生，難以凈化，應(yīng)采用全進(jìn)全出的雞群飼養(yǎng)管理辦法，可有效地減少本病的發(fā)生；不同的飼養(yǎng)周期選用合理的飼料配方，增加礦物元素和維生素，提高雞群的免疫力；對(duì)進(jìn)出場(chǎng)區(qū)的人員、車輛、物品進(jìn)行消毒后，才能準(zhǔn)入，嚴(yán)禁人員串舍，切斷病毒傳播幾率。

5 小 結(jié)

該雞場(chǎng)由于在產(chǎn)蛋前未接種過雞傳染性鼻炎疫苗，產(chǎn)蛋后由于溫度變化，導(dǎo)致雞群應(yīng)激，引起呼吸道癥狀，進(jìn)而伴隨其他呼吸道疾病的繼發(fā)感染，使疫情變得復(fù)雜。可依據(jù)臨床表現(xiàn)和剖檢進(jìn)行初步診斷，進(jìn)一步需用RT-PCR進(jìn)行診斷，該飼養(yǎng)場(chǎng)在發(fā)現(xiàn)病情確診后，緊急進(jìn)行雞傳染性鼻炎疫苗的預(yù)防接種，在短時(shí)間內(nèi)緩解了病情。對(duì)雞傳染性鼻炎的防治要進(jìn)行科學(xué)的疫苗接種和飼養(yǎng)管理，才能提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。