李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

兔病毒性出血癥病毒（RHDV）僅能感染兔，引起兔病毒性出血癥（RHD），該病是兔常見的一種烈性、高度傳染致死性疾病[1]。臨床表現(xiàn)主要為呼吸系統(tǒng)出血，實質(zhì)器官淤血、腫大、出血和肝壞死，是危害養(yǎng)兔業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一[2]。主要危害2月齡以上兔，潛伏期短、發(fā)病急、病程短，各品種兔均可感染發(fā)病，傳播速度快，發(fā)病率和死亡率高，可達(dá)90%，給養(yǎng)兔業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。病兔和帶毒兔是主要傳染源，主要通過呼吸道、消化道等直接接觸方式傳播。1984年首先在我國江蘇省首先發(fā)生該病，隨后在世界各地均有相關(guān)報道[3]。OIE將該病列為B類傳染病，我國將其列為二類傳染病。

兔病毒性出血癥病毒其病毒粒子為球形，直徑大小為32～36 nm，無囊膜，二十面體立體對稱，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長7 437個核苷酸。對外界環(huán)境抵抗力強，對乙醚、氯仿和PH3有抵抗力。病毒基因組變異速度慢，可能因兔子一般發(fā)病急，病程短有關(guān)。2010年法國首先報道了一種新型變異性兔瘟病毒稱為RHDV2或RHDVb，其基因序列與RHDV具有82.4%的同源性。目前，已在西班牙、德國、葡萄牙等多個國家爆發(fā)流行，引起的病變與經(jīng)典兔瘟類似，但是能感染致死30日齡以內(nèi)的兔和一些野兔品種，傳統(tǒng)滅活疫苗效果不理想[4]。目前我國尚無RHDV2發(fā)病的相關(guān)報道，但是隨著國際交流合作的不斷深入，該病傳入我國的風(fēng)險不斷增加。

當(dāng)前實驗室檢測RHDV包括病毒的分離，血凝實驗、ELISA實驗、RT-PCR等，這些方法都存在著各種弊端，或操作繁瑣、時間長，或敏感性低，或不能進行早期快速確診[5-6]。

熒光定量PCR技術(shù)經(jīng)過20多年發(fā)展已經(jīng)成熟，SYBR GreenⅠ染料法與TaqMan探針法相比，特異性太差，不適合臨床檢測[7-9]。探針法熒光PCR檢測已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種疾病早期快速確診，但關(guān)于RHDV熒光PCR檢測相關(guān)研究報道較少?；诖?，本試驗建立了RHDV一步法熒光PCR快速檢測方法，應(yīng)用于臨床，可實現(xiàn)RHD早期快速確診，從而采取相應(yīng)措施，減少養(yǎng)殖場損失。

1 材料與方法

1.1 病毒株與病料

兔病毒性出血癥病毒（RHDV）、兔巴氏桿菌、兔大腸桿菌、兔沙門氏菌、兔水皰性口炎病毒（RVSTV）和兔輪狀病毒（RRV）等均為本實驗室貯存，臨床檢測樣品為從山東各地兔場疑似RHDV感染的兔肝。

1.2 試劑和試劑盒

PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2 為大連寶生物公司產(chǎn)品，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自百泰克生物技術(shù)有限公司，AxyPrep病毒基因組提取試劑盒為杭州愛思進生物公司產(chǎn)品。

1.3 引物和探針

據(jù)GenBank公布的RHDV基因序列，設(shè)計兩條引物和1條TaqMan水解探針，引物和探針序列如下：RHDV-F1：5'-TACTTTACACCGTCCAACATT CT-3'和 RHDV-R1： 5'-AACCAACCGCCCACCAAA-3'，特異性探針為P1：5'-GCCGTGCTGAGCCAGAT GTATGCTG-3'，其中探針熒光基團標(biāo)記的為FAM，淬滅基團標(biāo)記的為BHQ1，引物和探針均由生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取

參照AxyPrep病毒基因組提取試劑盒說明書，分別提取RHDV、RVSTV和RRV等核酸作為模板。同時用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取兔常見細(xì)菌如兔巴氏桿菌、兔大腸桿菌、兔沙門氏菌的核酸作為模板。

1.5 熒光PCR檢測方法

熒光PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中2×1 Step Buffer 10 μL，PrimeScript? 1 Step Enzyme Mix 0.8 μL，模板2 μL，濃度為10 μmol·L-1的引物，濃度為5 μmol·L-1的探針的加入量進行適度調(diào)整，最后純化水補充總體積為20 μL，瞬時離心后，置便攜式熒光PCR儀MyGo mini中，分別以53、54、55、56、57、58、59、60℃等不同的退火溫度進行擴增反應(yīng)，選取能獲取低的CT和較高的熒光強度增加值的退火溫度和引物及探針濃度做熒光PCR反應(yīng)最適條件[10]。

1.6 敏感性實驗

按李天芝等方法測定RHDV組織毒的LD50[11]。10倍系列梯度稀釋7次后，即10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分別取 RHDV 組織毒原液及稀釋后7種病毒液100 μL，按照病毒基因組提取試劑盒說明書操作，分別提取RHDV核酸，作為模板，按優(yōu)化后的程序及反應(yīng)條件，分別擴增檢測，以確定所建方法的敏感性。

1.7 特異性實驗

分別以提取的RHDV、兔巴氏桿菌、兔大腸桿菌、兔沙門氏菌、RVSTV和RRV核酸作為模板，采用所建立的熒光PCR方法進行檢測，以檢驗所建方法是否與兔常見病原有交叉反應(yīng)。

1.8 重復(fù)性實驗

取測定LD50的RHDV組織毒液3份，分別按1.6所述稀釋，均取10-1、10-2、10-33種不同稀釋度，分別提取核酸進行熒光檢測，根據(jù)Ct值的不同，算出組內(nèi)和組間變異系數(shù)，以檢驗所建方法的重復(fù)性是否良好。

1.9 臨床樣品檢測

2018年8 月～2019年4月共從兔場收集疑似RHD病料樣本89份，采用優(yōu)化后PCR加樣體系和擴增程序進行熒光PCR擴增反應(yīng)，同時對病料樣本采用普通RT-PCR方法進行檢測，比較兩種方法所得到的檢測結(jié)果。

2 試驗結(jié)果

2.1 熒光PCR檢測方法

在反應(yīng)程序固定不變的情況下，通過不斷優(yōu)化加樣體系中引物和探針濃度，最終確定當(dāng)總反應(yīng)體系20 μL時，引物RHDV-F1加入量為1 μL，RHDV-R1加入量為1.2 μL，而探針加入量為0.8 μL，這樣才能達(dá)到最好的擴增效果。保持引物和探針加入量不變的情況下，優(yōu)化后的退火溫度為55℃，即在此溫度下能獲得最低的Ct和高的熒光強度增加值。

2.2 敏感性實驗

RHDV組織毒LD50測定結(jié)果為105.14LD50·100 μL-1，10倍系列梯度稀釋7次后，即分別為104.14LD50·100μL-1、103.14LD50·100 μL-1、102.14LD50·100 μL-1、101.14LD50·100 μL-1、100.14LD50·100 μL-1、10-0.86LD50·100 μL-1、10-1.86LD50·100 μL-1，結(jié)果顯示，100.14LD50·100 μL-1的梯度檢測結(jié)果仍然為陽性，10-0.86LD50·100 μL-1、10-1.86LD50·100 μL-1則為陰性，說明該法檢測限度為稀釋為100.14LD50·100μL-1（1.38LD50·100 μL-1）的RHDV組織毒。

2.3 特異性檢驗

用所建方法分別檢測兔病原核酸，結(jié)果顯示僅樣品RHDV，F(xiàn)AM熒光檢測時出現(xiàn)單一S型擴增曲線，其余兔巴氏桿菌、兔大腸桿菌、兔沙門氏菌、RVSTV和RRV樣本核酸檢測結(jié)果均為陰性，說明方法特異性好。

2.4 熒光PCR重復(fù)性實驗

3份RHDV組織毒液10-1、10-2、10-33種不同稀釋梯度分別用建熒光PCR方法檢測重復(fù)檢驗3次，根據(jù)所得Ct值，計算組內(nèi)和組間變異系數(shù)，結(jié)果顯示，變異系數(shù)＜1.5%，說明方法重復(fù)性好，見表1。

表1 實時熒光PCR的組內(nèi)和組間重復(fù)性實驗結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

用所建熒光PCR檢測方法及常規(guī)RT-PCR方法，同時檢測臨床疑似RHDV感染兔組織病料樣本，結(jié)果顯示，熒光PCR檢出率高于常規(guī)RT-PCR，二者符合率為96.6%，檢測結(jié)果如表2。

表2 兩種方法臨床樣品檢測結(jié)果

3 討論

王波等建立了RHDV SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法，結(jié)果表明，該法可檢測到的模板的最低拷貝數(shù)為8.18×101copies，只能特異性擴增RHDV，pGM19-T-EBHSV、兔巴氏桿菌、兔沙門氏菌、兔大腸埃希菌和健康兔組織RNA的擴增均為陰性，具有良好的特異性和重復(fù)性[12]。蒙正群等根據(jù)公布的RHDV VP60基因保守序列設(shè)計2條引物和1條探針，優(yōu)化條件后，建立了基于TaqMan探針的RHDV熒光定量PCR檢測方法，該方法特異性好，對健康家兔組織cDNA、家兔巴氏桿菌、家兔沙門菌、家兔大腸桿菌核酸均無擴增，敏感性高，檢測限度為2.8×101copies·μL-1的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，通過對5種不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的3次重復(fù)性驗證檢測，表明方法具有很好的重復(fù)性，變異系數(shù)均≤2%[13]。

RHDV疑似臨床病料檢測時，首先需要提取RHDV核酸RNA。核酸提取的濃度和純度影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，核酸提取時間影響檢測反應(yīng)總時長。目前RNA提取方法主要有TRIzol Reagen手提法、磁珠法提取試劑盒和柱式提取試劑盒3種，TRIzol手提法操作繁瑣、時間長，適合實驗室檢測，對技術(shù)要求高，磁珠法提取試劑盒適合大量樣本機器提取，相比之下柱式提取試劑盒適合臨床樣本的基層現(xiàn)場快速檢測，因所需試劑可常溫保存運輸，配合小型離心機能迅速完成樣本核酸提取[14-15]。

RHD是兔常見多發(fā)的一種烈性、病毒性傳染病，該病發(fā)病急，傳播迅速，可造成兔大量死亡，兔場發(fā)病后損失慘重[16-18]。目前，RHD無特效藥物治療，疫苗接種是一種有效的防控措施[19]。但于所選用廠家疫苗的質(zhì)量問題、疫苗不合理的保存和運輸、不科學(xué)的免疫程序及疫苗免疫前野毒的隱性感染等問題，常導(dǎo)致兔場RHD疫苗免疫失敗而發(fā)病。高質(zhì)量兔瘟疫苗免疫家兔3～5 d后即能起到一定的保護作用，減少死亡，降低養(yǎng)殖場損失。只有在發(fā)病早期盡早確診，選用高質(zhì)量疫苗免疫才能減少RHDV排毒，減輕兔癥狀，減少發(fā)病兔數(shù)量。而這些都有賴于疾病快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)場診斷。本試驗所建立的方法配合商品化核酸柱式提取試劑盒和重量僅2 kg的便攜式熒光PCR儀MyGo mini，非常適合現(xiàn)場快速檢測RHDV，50 min可完成病料處理到結(jié)果分析的全過程，不需要特定試驗室，不用開蓋電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，避免了對環(huán)境的氣溶膠污染，較傳統(tǒng)RT-PCR檢測方法可節(jié)省至少一半時間，進一步降低了檢測成本，可為養(yǎng)殖場挽回?fù)p失，但研究所需設(shè)計需冷凍保存和運輸，對距離太遠(yuǎn)的邊遠(yuǎn)地區(qū)來說仍然不方便，打算下一步研制適合常溫保存和運輸?shù)腜CR凍干試劑，使用時只需加入純化水溶解，再加入模板即可，進一步簡化操作，提高方法的實用性。