李天天，王 華

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院超聲科，河南 洛陽 471000)

近年來，腦血管疾病死亡的人數(shù)逐年上升，且發(fā)病年齡逐步呈現(xiàn)年輕化趨勢[1]。目前，腦血管疾病是導(dǎo)致患者死亡和致殘的主要原因，其常見的疾病類型是頸動脈狹窄或閉塞，引起頸動脈狹窄或閉塞的發(fā)病機制主要是動脈粥樣硬化[2]。研究表明，動脈粥樣硬化過程中形成的新生血管可以加速斑塊生長，同時也會導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊的形成，而不穩(wěn)定斑塊破裂是導(dǎo)致心腦血管疾病最根本的始動因素[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)，斑塊內(nèi)新生血管生成可作為預(yù)測斑塊穩(wěn)定性的獨立指標(biāo)[4]。近年來，隨著超聲診斷技術(shù)的快速發(fā)展，超微血管成像(super micro-vascular imaging,SMI)和超聲造影(contrast-enhanced ultrasonography,CEUS)在多種疾病的診斷和治療中得到廣泛應(yīng)用，其具有操作簡單、方便快捷、無創(chuàng)傷、可重復(fù)、效果確切等特點，受到了臨床醫(yī)師和患者的高度認(rèn)可。本研究應(yīng)用SMI和CEUS評估斑塊內(nèi)新生血管,并與評估斑塊內(nèi)新生血管的金標(biāo)準(zhǔn)微血管密度(microvessel density,MVD)相對照，探討SMI與CEUS評估斑塊內(nèi)新生血管的價值，旨在篩選經(jīng)濟、無創(chuàng)、快捷篩查腦卒中高?；颊叩姆椒ǎ员阌嗅槍π缘丶霸邕M行臨床干預(yù)，預(yù)防腦血管事件的發(fā)生。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年9 月至 2019 年 5 月洛陽市中心醫(yī)院因頸動脈狹窄或閉塞住院擬行頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)治療患者 40 例為研究對象，其中男29例，女11例；年齡48～79(65.9±6.8)歲；無相關(guān)臨床癥狀者 3 例，有冠狀動脈粥樣硬化性心臟病史 12 例，中風(fēng)史 11 例，具有高血糖、高血脂、高血壓、煙酒嗜好等高危因素者 30 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)常規(guī)超聲檢查發(fā)現(xiàn)低回聲及低回聲為主的混合回聲斑塊者；(2)年齡>18歲；(3)簽署頸動脈超聲造影檢查知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重心臟、肝臟、腎臟功能不全者；(2)意識不清不能配合檢查者；(3)存在高回聲及高回聲為主的混合回聲斑塊者；(4)超聲造影劑使用禁忌證者，包括已知對六氟化硫或造影劑其他成分有過敏史者；(5)近期急性冠狀動脈綜合征或臨床不穩(wěn)定性缺血性心臟病患者，包括正漸變?yōu)榛蜻M行性心肌梗死患者；(6)過去7 d 內(nèi)心臟癥狀出現(xiàn)明顯惡化者；(7)剛接受冠狀動脈介入手術(shù)者或存在其他提示臨床不穩(wěn)定的因素(如最近心電圖、實驗室或臨床所見提示的惡化)者；(8)急性心力衰竭，心功能III/IV級及嚴(yán)重心律失常的患者；(9)伴有右向左分流的心臟病患者、重度肺動脈高壓患者(肺動脈壓>90 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)、未控制的高血壓患者和成人呼吸窘迫綜合征患者；(10)孕婦及哺乳期患者。行頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)的指征：(1)伴有頭暈、肢體無力等臨床癥狀的患者，頸動脈截面積狹窄率>50%；(2)無任何臨床癥狀者，頸動脈截面積狹窄率>70%。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器CD34抗體購自洛陽傳奇生物科技公司，二抗(山羊抗兔)、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色液(diaminobenzidine，DAB)購自丹麥丹科股份有限公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation，PBS)購自北京三藥科技開發(fā)公司，蘇木精購自北京九州柏林生物科技有限公司，SonoVue造影劑購自意大利Bracco公司；東芝500 彩色多普勒超聲診斷儀購自日本東芝公司，電子顯微鏡、切片機購自德國萊卡公司。

1.3 頸動脈斑塊內(nèi)新生血管SMI和 CEUS檢查所有患者術(shù)前均行頸動脈斑塊SMI和 CEUS超聲檢查，應(yīng)用高頻線陣探頭，頻率4～11 MHz,此儀器具有 SMI和 CEUS 技術(shù)軟件。所有超聲檢查均由從事副主任醫(yī)師崗位工作3 a以上者指導(dǎo)完成。患者取平臥位，頭略偏向被檢側(cè)對側(cè)，暴露頸部，探頭橫向、縱向掃查頸動脈，保持探頭不動，于目標(biāo)斑塊處啟動SMI模式，參數(shù)設(shè)置為MI=1.5，difft=8.0，G=77，DR=600。設(shè)置后取每個斑塊橫切面由上肩部至下肩部的圖像及縱切面由頂部至基底部的圖像，觀察斑塊內(nèi)有無新生血管及評估新生血管豐富程度，存儲圖像。打開實時CEUS 模式，參數(shù)設(shè)置為MI=0.08，頻率1.7～3.4 MHz，12幀·s-1，深度5 cm，聚焦于頸動脈水平。參數(shù)設(shè)置后保持不變。按常規(guī)配制 SonoVue造影劑(59 mg六氟化硫微泡和4.8 mL生理鹽水混合后，人工劇烈震蕩直至凍干粉末完全分散)。將微泡混懸液抽吸至注射器，應(yīng)用20 G套管針穿刺肘正中靜脈，團注1.6 mL后，尾隨2～3 mL生理鹽水沖管。在注射造影劑后觀察頸動脈腔內(nèi)造影劑顯影效果。存儲頸動脈腔內(nèi)出現(xiàn)造影劑前3個心動周期及后15個心動周期的圖像以供實時動態(tài)分析，觀察斑塊內(nèi)有無新生血管,評估新生血管的豐富程度。由于SMI及CEUS 評估新生血管均為線狀或點狀強回聲，因此采取同樣的分級標(biāo)準(zhǔn)，0級：斑塊內(nèi)無增強；1 級：斑塊內(nèi)1～3 個點狀增強；2級：斑塊內(nèi)3個以上點狀和(或)1～2處短線狀增強；3級：斑塊內(nèi)2處以上線狀增強，并貫穿或大部貫穿斑塊，或有流動感[5]。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測頸動脈斑塊中的MVD值由血管外科醫(yī)生對患者實施頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)，首先于患側(cè)下頜角上下位置切開胸鎖乳頭肌內(nèi)緣，顯露頸動脈，用夾子將頸總動脈、頸動脈、頸外動脈及其分支血管阻斷，然后根據(jù)造影顯示的狹窄范圍，沿縱軸切開頸內(nèi)動脈至頸總動脈的狹窄部分，用剝離子將增生狹窄的部分切掉，將頸動脈內(nèi)膜剝開，恢復(fù)頸動脈的通暢性。將取下的完整斑塊送病理檢查，選擇斑塊的肩部、基底部、頂部進行多處取材，并將其切成適宜大小的組織塊，使用乙醇脫水，石蠟包埋，制備石蠟切片，石蠟切片脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，滴加CD34抗體，37 ℃孵育1～2 h，PBS沖洗3次，每次 5 min，滴加生物素標(biāo)記二抗(山羊抗兔)，37 ℃孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，高倍顯微鏡下觀察，細胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色為CD34陽性，即血管內(nèi)皮細胞。計數(shù)新生血管數(shù)量的方法：呈現(xiàn)CD 34陽性的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇均計為1個血管；取血管著色最密集的3個視野(每個視野面積為0.785 mm2)，計數(shù)MVD，取均值。

2 結(jié)果

2.1 SMI、CEUS及MVD法檢測頸動脈斑塊內(nèi)新生血管檢出率比較結(jié)果見圖1。40例患者中，SMI檢出斑塊內(nèi)新生血管31例(77.5%)，CEUS檢出斑塊內(nèi)新生血管33例(82.5%)，MVD法檢出頸動脈斑塊內(nèi)新生血管37例(92.5%)，SMI、CEUS檢測頸動脈斑塊內(nèi)新生血管的檢出率低于MVD法，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=3.530、1.830，P>0．05)。

2.2 SMI、CEUS評估頸動脈斑塊內(nèi)新生血管分級程度與MVD的相關(guān)性SMI評估新生血管行分級程度中 0、1、2、3級分別為9、10、11、10例，其MVD分別為(5.00±3.84)、(13.70±3.59)、(21.82±4.02、30.80±3.74)個·mm2；CEUS評估新生血管分級程度中0、1、2、3級分別為7、8、11、14例，其MVD分別為(5.71±5.65)、(13.00±4.44)、(18.82±4.58)、(28.64±4.88)個·mm2。不同程度SMI、CEUS分級患者的MVD均呈遞增趨勢，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)；SMI、CEUS評估新生血管分級程度與MVD呈正相關(guān)(r=0.911、0.883，P<0.01)。

A:SMI 0級斑塊內(nèi)無增強()；B:CEUS 0級斑塊內(nèi)無增強()；C：CD34 免疫組織化學(xué)染色(×200)，無新生血管；D:SMI 1級斑塊內(nèi)2個點狀增強()；E:CEUS 1級斑塊內(nèi)2個點狀增強()；F:CD34 免疫組織化學(xué)染色(×200)，見少量新生血管()；G:SMI 2級或3級斑塊內(nèi)線樣貫穿增強或3個以上點狀增強()；H:CEUS 2級或3級斑塊內(nèi)線樣貫穿增強或3個以上點狀增強()；I:CD34 免疫組織化學(xué)染色(×200)，見豐富新生血管()。

圖1 SMI、CEUS及MVD法檢測頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管

Fig.1 Detection of neovascularization in carotid atherosclerotic plaques by SMI,CEUS and MVD

3 討論

頸動脈粥樣硬化斑塊是缺血性腦血管病的危險因素之一，而缺血性腦血管病的主要發(fā)病機制是血管管腔狹窄引起血流動力學(xué)改變及不穩(wěn)定斑塊脫落形成栓子。當(dāng)前研究認(rèn)為，不穩(wěn)定斑塊及有癥狀的頸動脈疾病與斑塊內(nèi)新生血管數(shù)量呈正相關(guān)，通過對斑塊內(nèi)新生血管的評估，可以初步判斷斑塊的穩(wěn)定性[6]。新生血管的形成之所以能夠使斑塊變得不穩(wěn)定，其原因可能是新生血管僅由血管內(nèi)皮細胞組成，無平滑肌細胞，周圍也無結(jié)締組織和基底膜，故其脆性和通透性增加，易破裂出血；新生血管會釋放大量的黏附因子，促使炎性細胞聚集和浸潤，加重內(nèi)皮細胞的損傷[7]。因此,采取有效的影像學(xué)方法及早評估頸動脈斑塊的穩(wěn)定性，尤其是觀察斑塊內(nèi)是否存在新生血管，并對其進行干預(yù)，可有效減少發(fā)生心腦血管事件的風(fēng)險。

目前，針對頸動脈斑塊內(nèi)新生血管的影像學(xué)檢查方法很多，如計算機斷層攝影術(shù)血管造影、磁共振成像技術(shù)、動脈造影、血管內(nèi)超聲、光學(xué)相干斷層掃描等[8]，但這些檢查方法可重復(fù)性差，價格偏貴，患者不易接受。近年來,隨著超聲技術(shù)迅速發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn),CEUS在檢測頸動脈斑塊新生血管方面具有很高的敏感性，該檢查方法不僅無創(chuàng)、可重復(fù)性強，便于臨床推廣，而且實時顯像、無造影劑外溢至血管外，能夠?qū)Π邏K內(nèi)新生血管進行直觀清晰顯示[9]。而SMI作為一種新型血管成像技術(shù)，可以更敏感地捕捉低速血流，能夠有效對頸動脈斑塊新生血管患者進行診斷[10]。有研究顯示，SMI、CEUS對于斑塊內(nèi)部新生血管、斑塊穩(wěn)定性的診斷結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)MVD法具有高度一致性[11]。本研究運用SMI和CEUS技術(shù)檢測頸動脈斑塊內(nèi)新生血管，并與評估斑塊內(nèi)新生血管的金標(biāo)準(zhǔn)MVD相對照,結(jié)果顯示，SMI、CEUS檢測頸動脈斑塊內(nèi)新生血管的檢出率與MVD法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而且不同SMI、CEUS分級患者的MVD均呈遞增趨勢，SMI、CEUS評估新生血管豐富程度與MVD呈正相關(guān)，提示SMI和CEUS可以準(zhǔn)確檢測頸動脈斑塊內(nèi)新生血管，而且這2種方法均可實施實時無創(chuàng)檢查。

綜上所述，利用SMI、CEUS技術(shù)能夠準(zhǔn)確評估頸動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管情況，為臨床評估患者頸動脈斑塊的穩(wěn)定性、早期診斷及制訂治療方案提供更多、更準(zhǔn)確的信息，在臨床診治中有重要的應(yīng)用價值。