陳曉榕 王海峰 左毅剛

在全球范圍內(nèi)，膀胱癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第9位，約20%～30%的患者在初次就診時即被診斷為肌層浸潤性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, MIBC)，即使初次診斷為非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)也有10%～30%的患者進展為MIBC[1]。2015年，中國膀胱癌僅在男性患者中的全年新發(fā)病例約為6.2萬例，發(fā)病率為8.83/10萬[2]。目前診斷和監(jiān)測膀胱癌的主要手段依然是膀胱鏡檢查和活檢，但膀胱鏡作為一種侵入性檢查，在膀胱癌的監(jiān)測上比較費力、耗時，所以急需一種簡便和敏感性、特異度均較高的檢測方法來診斷、監(jiān)測膀胱癌的復(fù)發(fā)和進展。自2007年Valadi等[3]闡述了外泌體在細胞間遺傳物質(zhì)交流中發(fā)揮的重要作用并引發(fā)眾多學(xué)者的興趣后，國內(nèi)外學(xué)界也掀起一股研究外泌體的熱潮。隨后，大量的研究表明了外泌體在腫瘤的生長、發(fā)展、診斷及治療方面具有重要意義[4-7]。本文將重點闡述外泌體在膀胱癌診療中的應(yīng)用及研究進展。

一、外泌體

外泌體是由正常細胞或腫瘤細胞自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌的一種直徑約30～100 nm的胞外囊泡，并由磷脂雙分子層特異性地將蛋白質(zhì)、微小RNA(microRNA, miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)等物質(zhì)包裹其內(nèi)，可穩(wěn)定存在于體液中。外泌體不僅可作為“垃圾袋”將親代細胞內(nèi)無用或多余的細胞成分轉(zhuǎn)移至細胞外，也可作為信使在細胞間進行信息傳遞。

1.外泌體的包埋作用：雖然我們已經(jīng)知道外泌體中含有大量的蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)等，但這些物質(zhì)被包裹到外泌體中的機制尚未被明確。Villarroya-Beltri等[8]將人類原始T細胞提取的外泌體分別與不同涂層的鏈霉親和素珠，包括生物素化的外泌體miRNA(miRNA-198)涂層、生物素化的胞漿miRNA(miRNA-17)及陰性對照(poly-A)涂層或無涂層的鏈霉親和素珠，進行共同培養(yǎng)，然后通過質(zhì)譜分析法、免疫沉淀、qPCR、電泳遷移率改變試驗等方法，證明了一種普遍存在的RNA結(jié)合蛋白——不均一型核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1, hnRNPA2B1)在外泌體中泛素化后與miRNA-198中的GGAG/CCCU序列特異性結(jié)合，可介導(dǎo)miRNA-198主動進行外泌體包埋，這種作用可能取決于hnRNPA2B1和細胞骨架成分相互作用的能力。同時將GGAG/CCCU序列進行突變，發(fā)現(xiàn)miR-198與hnRNPA2B1結(jié)合被抑制。此外Santangelo等[9]也發(fā)現(xiàn)另一種RNA結(jié)合蛋白——突觸素結(jié)合細胞質(zhì)RNA作用蛋白(synaptotagmin-binding cytoplasmic RNA-interacting protein, SYNCRIP)通過與表達特異性短序列——hEXO序列的miRNA相結(jié)合，能夠介導(dǎo)miRNA在外泌體中的包埋作用，且將hEXO序列植入其他miRNA中以增強其在外泌體中的表達水平。以上試驗都說明了外泌體的內(nèi)含物并不是被隨機分配，而是通過某些確切的分子機制進行包埋的。

2.外泌體與受體細胞的作用方式：外泌體由親代細胞分泌后可通過以下方式靶向地與受體細胞相結(jié)合：①外泌體被受體細胞膜完全內(nèi)吞，將囊泡內(nèi)物質(zhì)傳遞至受體細胞中，包括脂質(zhì)筏介導(dǎo)、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用[10-11]。②外泌體表面的跨膜蛋白(如PGRL、LAMP1、LAMP2等)與受體細胞相應(yīng)受體直接接觸，進行細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。③外泌體與受體細胞膜直接接觸，通過質(zhì)膜融合的方式將外泌體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)[11]。上述作用方式都說明了外泌體內(nèi)的物質(zhì)并不是黏附于細胞表面而是被腫瘤細胞攝取的。這與Franzen等[12]以PKH-26標(biāo)記外泌體后與膀胱癌細胞共培養(yǎng)，通過IDEAS軟件對PKH-26的熒光強度和PKH-26+點數(shù)測定的結(jié)果是一致的。

二、外泌體與膀胱腫瘤微環(huán)境

到目前為止，大量的研究已經(jīng)證明外泌體與腫瘤細胞或周圍正常組織細胞之間存在信息交流，這在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要意義。Zheng等[13]首次證實了正常細胞分泌的外泌體中磷酸酶和張力蛋白同源基因同源物假基因1(phosphatase and tensin homolog pseudogene 1, PTENP1)減少可促進膀胱癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提示正常組織細胞與膀胱癌細胞間存在信息交流。同樣在Park等[4]的研究中，體外培養(yǎng)膀胱腫瘤T24系細胞后通過超速離心提取外泌體，再分別比較經(jīng)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PBS)處理和提取的外泌體處理后的淋巴管內(nèi)皮細胞(lymphatic endothelial cells, LECs)的增殖和轉(zhuǎn)移情況，發(fā)現(xiàn)外泌體可增強LECs的增殖和轉(zhuǎn)移(P<0.05)，且LECs分泌的外泌體也具有吸引膀胱癌細胞并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)移的作用。Ringuette等[14]的研究表明膀胱癌源性的外泌體可以通過激活TGFβ/SMAD信號通路使正常的膀胱成纖維細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y相關(guān)性成纖維細胞，從而促進膀胱癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

除外泌體與周圍組織細胞的信息交流可導(dǎo)致腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移外，還有研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌源性外泌體可通過增強上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)，從而達到促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的效應(yīng)。Xue等[15]在正?；蛉毖鯒l件下分離出高表達lncRNA-UCA1的膀胱癌5637系細胞源性外泌體后，與低表達lncRNA-UCA1的膀胱癌UMUC2系細胞共同培養(yǎng)，并通過透射電鏡、納米顆粒追蹤和蛋白印跡分析進行鑒定，評估細胞的增殖、遷移和侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低氧狀態(tài)下的5637系細胞產(chǎn)生的外泌體中l(wèi)ncRNA-UCA1表達明顯升高，并通過EMT促進UMUC2系膀胱癌細胞的生長和進展。Franzen等[16]通過超速離心的方法從浸潤性膀胱癌T24或UMUC3系細胞培養(yǎng)液或是直接從患者的尿液中提取外泌體，然后將其與尿路上皮細胞共同培養(yǎng)，通過評估其EMT水平后發(fā)現(xiàn)，相比于PBS處理后的尿路上皮細胞，經(jīng)膀胱癌外泌體處理后的尿路上皮細胞所表達的間質(zhì)細胞標(biāo)志物(包括α-平滑肌動蛋白、S100A4等)明顯上調(diào)。

三、外泌體內(nèi)含物與膀胱癌的診斷

作為標(biāo)志物應(yīng)具有易分離、易獲取、敏感度及特異性高等特點。外泌體廣泛存在于人的體液中，如血液、尿液等，可通過相對無創(chuàng)的方法獲取，且相較于裸露在細胞外液中的miRNA、lncRNA等物質(zhì)而言，外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，能在4 ℃或-20 ℃過夜儲存的條件下不影響外泌體的攝取[17]，這說明外泌體可穩(wěn)定存在于體液中。Baumgart等[18]通過比較不同侵襲力的膀胱尿路上皮癌細胞系及其外泌體的miRNAs表達，首次闡明了外泌體內(nèi)的分子含量與親代細胞是部分相似的，這為外泌體作為膀胱癌的診斷標(biāo)志物提供了理論基礎(chǔ)。

1.蛋白質(zhì)：Chen等[19]識別了2 964種存在于人類尿液外泌體中的蛋白，其中107種被選做候選標(biāo)志物，并采用液相-二級質(zhì)譜聯(lián)用法對膀胱癌患者(n=28)和疝氣患者(n=12)的尿液標(biāo)本中的29種蛋白進行精確定量，其中有24種蛋白的表達在二者之間有顯著差異(P<0.05)。隨后用酶聯(lián)免疫法證實了TACSTD2在膀胱癌患者中的表達比疝氣患者高出2.1～3.9倍，在閾值為 2.47 ng/ml時，其敏感度和特異性分別為73.6%和76.5%，且在不同級別膀胱癌患者中的表達也有差異(P=0.014)。 Silvers等[20]獲取正常尿路上皮組織(n=9)、Tcis(n=13)、不包括Tcis的NMIBC(n=15)、MIBC(n=13)分泌的外泌體，并分析其蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)S100A4、HEXB、SND1及TALDO1在膀胱癌患者尿液外泌體中的水平具有顯著差異(P<0.05)。其中MIBC細胞質(zhì)中TALDO1的比例顯著下降，且與腫瘤特異性生存率呈正相關(guān)(P=0.008)。Tsumura等[21]分別檢測不同分期的膀胱尿路上皮癌患者(n=52)和健康對照組患者(n=28)術(shù)前血清中尿蛋白Ⅲ水平，結(jié)果顯示膀胱癌患者的尿蛋白Ⅲ水平與對照組相比明顯升高(P<0.05)，且其升高水平與肌層浸潤程度、病理分級、淋巴血管侵犯呈正相關(guān)(P<0.02)。這一系列研究說明外泌體的蛋白質(zhì)表達在膀胱癌患者中具有顯著的特異性，因此通過對外泌體蛋白質(zhì)表達的評估可以幫助我們在臨床上區(qū)別膀胱癌患者與健康人，甚至是區(qū)分膀胱癌的分級、分期。

2.miRNA：Baumgart等采用基因芯片技術(shù)證實在MIBC與NMIBC細胞分泌的外泌體中，7種miRNA包括 miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-205-5p、miR-224-5p和miR-429-3p表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢，而另外2種miRNA包括miR-99a-5p、miR-137-3p則呈上調(diào)趨勢。Andreu等[22]分別提取健康人、低級別膀胱癌和高級別膀胱癌患者尿液外泌體，用RT-qPCR技術(shù)檢測let-7c、miR-30c-2、miR-146a-5p、miR-194-5p和miR-375的表達水平，結(jié)果顯示miR-375在高級別膀胱癌患者外泌體中明顯下調(diào)(P=0.03)，而miR-146a則在低級別膀胱癌患者中呈上調(diào)趨勢(P=0.03)。以上實驗說明在不同級別的膀胱癌患者中miRNA的表達水平是有差異的，同時，也提示可以通過尿液外泌體miRNA定量分析對膀胱癌患者進行分期、分級，并調(diào)整治療方案。事實上單個的miRNA表達異?？赡軐Π螂装┑脑\斷存在偏差，這時可以考慮聯(lián)合多個miRNA指標(biāo)達到更高的診斷效能。如Miah等[23]分別對膀胱癌患者(n=68)和與其年齡相匹配的對照組(n=53)中的15種miRNA進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)miR-1224-3p在診斷膀胱癌方面的特異性為83%，敏感度為77%，聯(lián)合miR-15b、miR-135b和miR-1224-3p的診斷敏感度可達到94.1%。Hanke等[24]則提出尿液外泌體中miR-126與miR-152 的比值在膀胱癌診斷中的特異性為82%，敏感度為72%。

3.lncRNA：Berrondo等[25]對膀胱尿路上皮癌患者(n=10)和健康對照組患者(n=7)進行l(wèi)ncRNA測序后，發(fā)現(xiàn)包括HYMA1、LINC00477、 LOC100506688和OTX2-AS1在內(nèi)的4種lncRNA在高級別膀胱癌患者外泌體中的表達明顯上調(diào)。Yan等[26]通過對110例Ta/T1期膀胱癌組織及其鄰近的正常組織HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)表達的檢測，發(fā)現(xiàn)HOTAIR高表達與膀胱癌的高復(fù)發(fā)率密切相關(guān)，這與Berrondo等敲除HOTAIR可減少腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和浸潤的結(jié)論一致。因此HOTAIR(HR=4.712，95%CI=2.894～8.714，P<0.001)可作為膀胱癌獨立的復(fù)發(fā)預(yù)測因子。Zheng等分別提取膀胱癌患者和健康對照組患者血清外泌體，通過受試者工作特征曲線分析得出PTENP1的表達水平對診斷膀胱癌的敏感度和特異性分別為65.4%和84.2%，且與病理分級呈負相關(guān)(P<0.05)，并證實PTENP1可拮抗miRNA-17以減少PTEN表達的效應(yīng)。Zhan等[6]采用受試者工作特征曲線分別對實驗組(n=208)和驗證組(n=160)共368個尿液樣本進行8種候選lncRNA表達的分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合MALAT1、PCAT-1和SPRY4-IT1 3種lncRNA對兩組膀胱癌患者診斷的曲線下面積(AUC)分別為0.854和0.813，均高于尿液細胞學(xué)檢測(AUC=0.619)。MALAT1、PCAT-1和SPRY4-IT13在膀胱癌患者中的表達明顯上調(diào)，其診斷敏感度和特異性分別為72.1%和84.6%、72.1%和81.7%、66.3%和76.9%。Kaplan-Meier分析表明PCAT-1(P<0.001)和MALAT1的表達與NMIBC患者的無復(fù)發(fā)生存率呈負相關(guān)(P=0.002)。

四、外泌體與膀胱癌的治療

基于外泌體可在細胞間進行信息交流的特點，學(xué)者們進行了大量以外泌體作為載體傳遞藥物的研究，并取得了良好的抑制腫瘤細胞增殖的效果。Greco等[27]從人胚胎腎293細胞(HEK293)和間充質(zhì)干細胞提取出外泌體，并通過電穿孔的方法將PLK-1小干擾RNA(small interfering, siRNA)和對照siRNA加載到外泌體中，并與膀胱癌UMUC3系細胞和正常上皮細胞共培養(yǎng)，在48 h后觀察到UMUC3系細胞在與加載了PLK-1 siRNA 外泌體共培養(yǎng)后增殖程度明顯降低(P<0.01)。Ha等[28]提出以人體自身細胞分泌的外泌體作為siRNA的載體可以避免巨噬細胞和溶酶體的吞噬作用，引發(fā)的免疫排斥反應(yīng)較小的觀點，更進一步地為外泌體的靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。還有其他將治療藥物裝載到外泌體中或?qū)⑼饷隗w制成疫苗等方式也可作為抗腫瘤靶向治療的方法，甚至有研究表明這樣可以減少藥物的劑量，對正常細胞產(chǎn)生更少的毒性作用[29]。Kumari等[30]則發(fā)現(xiàn)了一種在胞質(zhì)中的蛋白NF2，其表達程度在外泌體的形成中起著重要作用，貝伐單抗可通過抑制NF2介導(dǎo)外泌體生成的作用來阻斷蛋白與蛋白之間的相互作用，從而達到抑制膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的效應(yīng)。Viaud等[31]發(fā)現(xiàn)用IF-γ處理后的單核細胞來源的樹突細胞分泌的樹突細胞源性外泌體(Dex)與未成熟樹突細胞分泌的外泌體相比，表達了更高水平的CD40、CD80、CD86等分子，這使得IF-γ-Dex具有更強的免疫原性，能夠刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答，從而清除腫瘤細胞。目前這種IF-γ-Dex疫苗已進入大規(guī)模制作的Ⅱ期試驗。事實上基于外泌體特異性包埋、與受體細胞的作用方式及與腫瘤微環(huán)境之間的信息交流等特點，我們也可以通過調(diào)節(jié)上述過程使外泌體在腫瘤靶向治療中獲得滿意療效。

五、展望

隨著越來越多的研究證明外泌體在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，基于外泌體性能的腫瘤診斷和治療方法也逐漸受到大家的廣泛關(guān)注，相信在未來研究領(lǐng)域中，不同細胞來源外泌體的分泌機制和生理功能，以及如何控制外泌體的成分表達從而提高外泌體的抗腫瘤效應(yīng)[32]的一系列研究將成為膀胱癌研究領(lǐng)域的一大熱點。然而，現(xiàn)有的技術(shù)方法所提取出的外泌體純度不夠、破壞了外泌體的結(jié)構(gòu)或內(nèi)在成分，且提取成本過于昂貴[33]，因此限制了外泌體在臨床上的應(yīng)用。相信經(jīng)過多學(xué)科的合作，進行大樣本的臨床試驗后，我們可以將外泌體正式推進臨床醫(yī)生的視野里，也為膀胱癌患者提供更便捷、更經(jīng)濟、更準(zhǔn)確的診療方法。