(杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310022)

1 引言

硒，作為人體必須要的微量元素之一，它的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能越來越受到廣大人民的關(guān)注。21世紀(jì)隨著人民生活水平的提高，人們越來越注重養(yǎng)生，各種保健品，營養(yǎng)添加劑，各種輔食都被研發(fā)出來滿足人民生活需要，但是并不是說補(bǔ)的越多越好，也不是說任何形態(tài)的硒都能補(bǔ)[1]。硒元素在能被人體吸收的主要是有機(jī)硒，補(bǔ)硒能抗癌，抗氧化，提高免疫力，降低大骨節(jié)病與克山病的發(fā)病率。硒與人體合成紅細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶(RBC GSH-PX)、磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶(PHG-PX)、血漿谷胱甘肽過氧化物酶(PGSH-PX) 等都有密不可分的關(guān)系。硒還參與甲狀腺激素平衡，調(diào)控胰島素介導(dǎo)的代謝作用，磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(PHGPx,也是一種硒蛋白)受促性腺激素的調(diào)節(jié),參與精子的成熟等[2]。自然界中硒主要以無機(jī)硒的形式存在，但是無機(jī)硒不易吸收，而且人體攝入無機(jī)硒是有毒的。有機(jī)硒易吸收，但是產(chǎn)量低，價(jià)格高，易存在摻假牟取暴利。同時(shí)，硒攝入過多會(huì)引起硒中毒，導(dǎo)致脫發(fā)，掉指甲，無力等癥狀。因此合理開發(fā)利用硒，其重要意義在于保證富硒產(chǎn)品生產(chǎn)過程的安全。存在于食品中硒，有很多種形態(tài)，常見的化學(xué)形態(tài)為硒酸鹽(SeVI)、亞硒酸鹽(SeIV)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒代乙硫氨酸(SeEt)、三甲基硒(TMSe)、硒脲(SeUr) 等[3，4]。無法對有機(jī)硒的存在形態(tài)進(jìn)行定性以及定量分析的原因在于現(xiàn)行有效的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)測定結(jié)果，一般包括測定無機(jī)硒在內(nèi)的硒元素總量。目前，在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)缺乏的情況下，針對富硒農(nóng)產(chǎn)品的甄別以及食品安全監(jiān)測的情況，盡快開發(fā)更快、更準(zhǔn)確地分析農(nóng)產(chǎn)品中的各種硒形態(tài)的檢測方法，具有重要意義。

目前，在歷年文獻(xiàn)中出現(xiàn)有機(jī)硒形態(tài)檢測方法，包括有離子色譜-積分脈沖安培檢測法、高效液相色譜法、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP/MS)、液相色譜-原子熒光光譜法及其他聯(lián)用技術(shù)[5-14]，其中HPLC-ICP/MS 儀器設(shè)備昂貴、運(yùn)行成本高,不利于推廣應(yīng)用。高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用或高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是現(xiàn)在有機(jī)硒形態(tài)分析的主流方法，由此本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜聯(lián)用技術(shù)(high performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry, HPLC-HGAFS)檢測5種硒形態(tài)的方法，該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：原理簡單、實(shí)驗(yàn)操作快速、結(jié)果準(zhǔn)確，儀器性價(jià)比高，易推廣及應(yīng)用。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

AFS-933/ASP-20原子熒光形態(tài)分析儀(北京吉天儀器有限公司)；硒原子熒光空心陰極燈(北京有色金屬研究總院) ；AP-9925無油真空泵(天津奧特賽恩斯)；KQ-250E超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；Neofuge 15R臺式高速離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)。

氫氧化鈉(天津市光復(fù)科技有限公司)；硼氫化鉀(阿拉丁)、磷酸氫二胺(GR 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；四丁基溴化銨(麥克林)、甲醇(色譜純J.T.BaKer)、鹽酸(GR 永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司)；鏈霉蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司)；脂肪酶(瑪雅試劑)、淀粉酶(上海安普科學(xué)儀器有限公司)；氨水(AR杭州龍山精細(xì)化工有限公司)；甲酸(AR上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；97.9μg/g硒代蛋氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10034、68.9μg/g亞硒酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10032、93.5μg/g硒代胱氨酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10087、75.1μg/g硒酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10033(中國計(jì)量科學(xué)研究院)；Se-甲基硒代-L-半胱氨酸(純度98% 北京百靈威科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為實(shí)驗(yàn)室超純水。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

分別準(zhǔn)確吸取1.13mL、1.27mL、1.166mL、1.204mL硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、亞硒酸根、硒酸根于10mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，得濃度為5mg/L(以硒計(jì))的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確稱取Se-甲基硒代-L-半胱氨酸23mg于100mL容量瓶中加入1mL鹽酸，用超純水定容至100mL，得100mg/L(以硒計(jì))標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。儲(chǔ)存在0～4℃冰箱中。

使用前取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液置于10mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，混勻，得到一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度分別為10、30、50、100、200μg/L。

2.3 樣品處理

取一定量的富硒稻米試樣進(jìn)行粉碎、混勻，過0.850mm孔徑篩，稱取0.1g(精確至0.001g)富硒稻米樣品于10mL離心管中，稱取10mg鏈霉蛋白酶E溶于3mL超純水，渦旋混勻，置于超聲清洗器中，于水溫37℃，60min超聲提取。待提取結(jié)束后，于8000r/min離心20min，吸取上清液，過0.22μm的有機(jī)濾膜，然后上機(jī)進(jìn)行檢測，同時(shí)做樣品空白。

2.4 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱(C18，5μm，100?.4.6×150mm，海光儀器)；預(yù)柱(C18,5μm，100?.4.6×10mm，海光儀器)；柱溫箱溫度30℃；流動(dòng)相為30mmol/L磷酸氫二銨+0.5mmol/L四丁基溴化銨+2%甲醇，用甲酸調(diào)節(jié)pH至5.8～6.0；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為100μL；分析時(shí)間為10min。

氫化物發(fā)生器條件：載流：10%HCL；還原劑：2%KBH4+0.35%NaOH；氧化劑：0.1%KI+0.35%NaOH；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為65r/min。

原子熒光檢測條件：硒空心陰極燈，燈總電流90mA；輔陰極電流45mA；載氣屏蔽氣為氬氣，流量為300mL/min；屏蔽氣流量為600mL/min；光電倍增管負(fù)高壓為300V，原子化器高度為8mm。

3 結(jié)果與分析

3.1 儀器條件優(yōu)化

3.1.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的選擇對目標(biāo)化合物的分離及其重要，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，考慮到硒5個(gè)形態(tài)的分離效果和靈敏度，當(dāng)用磷酸氫二銨時(shí)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH，加入四丁基溴化銨與甲醇提高分離度與靈敏度時(shí)效果最好。磷酸二氫銨中不加四丁基溴化銨是會(huì)使Se-甲基硒代-L-半胱氨酸與亞硒酸根無法分離且靈敏度降低。因此本實(shí)驗(yàn)采用的流動(dòng)相為30mmol/L磷酸氫二銨+0.5mmol/L四丁基溴化銨+2%甲醇。

3.1.2 流動(dòng)相pH的選擇

pH不同時(shí)硒形態(tài)在水溶液中表現(xiàn)出不同的離子狀態(tài)，因此流動(dòng)相的pH對結(jié)果影響很大。本研究考察了磷酸氫二銨為流動(dòng)相時(shí)pH4、5、5.5、6、6.5時(shí)硒形態(tài)的分離效果。結(jié)果表明：當(dāng)pH為4時(shí)，亞硒酸根與硒代蛋氨酸重合，且所有峰都有毛刺；當(dāng)pH為5時(shí)，5個(gè)峰均已明顯分離，但是峰還是有很大的毛刺；當(dāng)pH為5.5～6時(shí)峰均已達(dá)到基線分離，且峰均平滑；當(dāng)pH 越低時(shí)，Se-甲基硒代-L-半胱氨酸靈敏度越高，硒酸根靈敏度越低，保留時(shí)間越長；當(dāng)pH為6.5時(shí)，硒代胱氨酸靈敏度降低，Se-甲基硒代-L-半胱氨酸與亞硒酸根有部分重合；pH 上升時(shí)硒酸根靈敏度上升，亞硒酸根靈敏度上升。因此，綜合各方面考慮本研究選擇pH6.0作為流動(dòng)相酸度。

3.1.3 流動(dòng)相濃度的選擇

本實(shí)驗(yàn)探討了20、30、40mmol/L的磷酸氫二銨溶液(pH6.0)對5種硒形態(tài)分分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)磷酸氫二銨溶液(pH6.0)濃度為20mmol/L時(shí)，硒酸根保留時(shí)間延長，亞硒酸根與硒代蛋氨酸重合；當(dāng)磷酸氫二銨溶液(pH6.0)濃度為30mmol/L時(shí)，可以達(dá)到基線分離；當(dāng)磷酸氫二銨溶液(pH6.0)濃度為40mmol/L時(shí)，硒酸根保留時(shí)間縮短，但是硒代胱氨酸、Se-甲基硒代-L-半胱氨酸、硒代蛋氨酸重合。因此本研究采用30mmol/L的磷酸氫二銨作為流動(dòng)相，此條件下，5種硒形態(tài)分離效果最好。

3.1.4 流動(dòng)相流速的選擇

流速對硒形態(tài)的分離效果也有很大影響，本研究考察了流速為0.5、0.8、1.0、1.2mL/min的磷酸氫二銨(pH6.0)時(shí)分離效果。當(dāng)流速為0.5mL/min時(shí)峰有毛刺、不圓滑。當(dāng)流速為0.8mL/min時(shí)峰也有毛刺。當(dāng)流速為1.0mL/min時(shí)，可以達(dá)到基線分離，峰圓滑。當(dāng)流速為1.2mL/min時(shí)出峰時(shí)間短但是峰達(dá)不到基線分離。因此本實(shí)驗(yàn)采用流速為1.0mL/min分離效果最佳。

3.2 提取條件的優(yōu)化

富硒食品中的硒的存在形態(tài)大多以硒代蛋白的形式存在。本實(shí)驗(yàn)以SeMet 陽性樣品( 通過噴施亞硒酸鹽種植出的水稻，即通過生物轉(zhuǎn)化方式實(shí)現(xiàn)無機(jī)硒向有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化)由廣西大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院提供(總硒含量3.25mg/kg)。因此實(shí)驗(yàn)主要優(yōu)化了鏈酶蛋白酶E不同提取時(shí)間、提取方式對樣品中形態(tài)的提取效果。通過考察鏈酶蛋白酶E于37℃超聲提取15、30、45、60min，結(jié)果表明：當(dāng)15 min超聲提取時(shí)，未提取完全；當(dāng)提取時(shí)間設(shè)置為45 min 和60 min 時(shí)，提取效率均達(dá)到較高值，考慮到硒形態(tài)特別是硒代胱氨酸穩(wěn)定性差[15]，本實(shí)驗(yàn)選用超聲時(shí)間為45 min。

3.3 保留時(shí)間和檢出限

按照材料與方法的操作對5種硒形態(tài)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：5種硒形態(tài)在10～200μg/L范圍內(nèi)的線性相關(guān)性較好，檢出限在2.27～3.89μg/L之間，結(jié)果見表1，標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖見圖1。

表1 5 種硒形態(tài)的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

圖1 5種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(100 μg /L)

3.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

選取另一種硒含量不同的富硒大米(總硒測定結(jié)果為1.25 mg/kg)作為實(shí)驗(yàn)樣品, 測此樣品各種形態(tài)的硒本底值, 再進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn), 分別對3 個(gè)濃度進(jìn)行添加回收, 每個(gè)濃度6 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：5 種硒形態(tài)的加標(biāo)回收率在85.4%～105.5%之間, 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.8%。結(jié)果見表2。

表2 大米中硒形態(tài)的加標(biāo)回收率(n=6)

3.5 樣品測定

應(yīng)用本研究所建立的方法測定了噴施了硒肥的富硒大米試樣中的有機(jī)硒形態(tài)，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在富硒大米中，僅存在硒代蛋氨酸含量(以硒計(jì))一種形態(tài)的有機(jī)硒。

4 結(jié)論

建立了高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜聯(lián)用技術(shù)(high performance liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry, HPLC-HG-AFS)檢測富硒大米中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、亞硒酸根、硒代蛋氨酸、硒酸根等5 種硒形態(tài)的方法。樣品采用鏈酶蛋白酶E水解超聲提取的方式，30mmol/L磷酸氫二銨+0.5mmol/L四丁基溴化銨+2%甲醇為流動(dòng)相，用甲酸調(diào)節(jié)pH至5.8～6.0，經(jīng)C18(5μm，100?.4.6×150mm)色譜柱分離后HG-AFS 測定，10min內(nèi)5種硒形態(tài)可以完全分離。各種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.995, 方法檢出限為2.27～3.89 μg/L。5種硒形態(tài)回收率在85.4%～105.5%之間。實(shí)驗(yàn)所建立的方法不僅可以對大米中硒的5 種形態(tài)快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行定性和定量分析,而且有助于對市場上魚龍混雜的富硒大米產(chǎn)品進(jìn)行真?zhèn)舞b別和品質(zhì)甄別，對開展食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測、評估具有重要意義。