張 爽,問娟娟,楊創(chuàng)勃2,高 潔,賴普輝

(1.陜西國際商貿(mào)學院醫(yī)藥學院,陜西西安 712046; 2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,陜西咸陽 712000)

瞿麥別名高山瞿麥,為石竹科石竹屬植物瞿麥(DianthussuperbusL.)或石竹(DianthuschinensisL.)的干燥地上部分。瞿麥性味苦,寒;具有利尿通淋,破血通經(jīng)之功效[1],其主要成分有皂苷類、環(huán)肽類、黃酮類、有機酸類、揮發(fā)油類、色素及多糖等,現(xiàn)代藥理研究表明:瞿麥具有抗腫瘤、利尿、興奮子宮、抗菌、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等作用[2-3]。瞿麥是一種觀賞植物,同時它又是一種常用的傳統(tǒng)中藥,主要用在一些復(fù)方制劑中。目前瞿麥被進一步開發(fā)成茶飲品—石竹茶(藥材名瞿麥),廣泛流行于北京、上海、青島等城市。

揮發(fā)油是一類次生代謝物質(zhì),是多種中草藥中的重要組成部分,它具有抗炎、抗過敏、抗微生物、抗氧化、抗病毒及抗腫瘤等多種生理活性[4]。目前,對于揮發(fā)性物質(zhì)提取的方法有許多,除傳統(tǒng)的壓榨法、有機溶劑浸提法、水蒸氣蒸餾法外,還有一些新興方法如:超臨界萃取法[5]、微波輻射法[6]、超聲輔助提取法[7]、酶輔助法[8]、離子液體輔助萃取法[9]等。因提取方法不同,所得化學組分不同,對中藥的藥理藥效也會產(chǎn)生影響。目前關(guān)于瞿麥中的揮發(fā)油的成分已有報道,余建清等[10]采用水蒸氣蒸餾法提取瞿麥中揮發(fā)油,對其成分進行了GC-MS聯(lián)用技術(shù)進分析,證實瞿麥中含有三十多種揮發(fā)油成分,其主要組分為6,10,14-三甲基-2-十五酮、植物醇、醋酸牻牛兒酯、正己醇和醋酸金合歡酯等。

微波能是一種由離子遷移和偶極子轉(zhuǎn)動而引起分子運動的非離子化輻射能,它是一種能直接作用到細胞內(nèi)部的加熱方式,微波輔助萃取可以使溶質(zhì)快速的進入溶劑,使溶出的效率更快,有效成分的得率更高[4]。目前,文獻中關(guān)于瞿麥中揮發(fā)油的提取方法及抗氧化活性方面的研究未見報道,本實驗采用響應(yīng)曲面法對微波輔助提取陜產(chǎn)瞿麥中的揮發(fā)油進行了工藝優(yōu)化,同時對微波輔助提取得到的瞿麥中的揮發(fā)油和相同條件下以超聲(功率120 W)輔助提取得到的揮發(fā)油的抗氧化活性進行了研究,以期為瞿麥在醫(yī)藥、食品、工業(yè)等方面的開發(fā)和應(yīng)用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瞿麥 陜西省眉縣藥材總公司,經(jīng)鑒定為石竹科植物瞿麥(DianthussuperbusL.)的帶花全草;正己烷、焦性沒食子酸、無水硫酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、濃鹽酸、磷酸二氫鈉 均為國產(chǎn)分析純;三羥甲基氨基甲烷(Tris) 北京華業(yè)寰宇化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 上海如吉生物公司;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT) 上海佳倫生物科技有限公司。

篩子(40目) 浙江上虞市道墟張興紗篩廠;SHZ-DШ真空泵 河南省予華儀器有限公司;TGL-15B離心機 上海安亭科學儀器廠;電熱鼓風干燥箱 上?，槴\實驗設(shè)備有限公司;微波萃取儀XH100B 北京詳鋯發(fā)展有限公司;FA2004精密電子天平(萬分之一) 上海越平科學儀器有限公司;UV2400紫外可見分光光度計 天津精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油的提取 稱取5.0000 g已處理好的瞿麥粉末(過40目篩),將有機溶劑按一定比例和藥材一起加入微波萃取儀中,根據(jù)實驗的要求在一定液料比、功率、時間條件下,回流提取后冷卻至室溫。抽濾,將濾液用無水碳酸鈉進行干燥,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀適量回收溶劑(溫度在溶劑沸點以下),水浴蒸干,即得陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油。

1.2.2 不同溶劑對陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率的影響 準確稱取已處理好的瞿麥粉末(過40目篩)5.0000 g,分別采用不同提取溶劑(乙醚、正己烷、石油醚)對瞿麥進行揮發(fā)油微波輔助提取,微波溫度為25 ℃,時間為6 min,功率為300 W,液料比為20∶1 mL/g,根據(jù)瞿麥揮發(fā)油的得率確定最佳溶劑。

1.2.3 微波輔助提取陜產(chǎn)瞿麥中揮發(fā)油的單因素實驗 以正己烷為提取溶劑,選定液料比、提取溫度、提取功率、提取時間四個因素,以瞿麥中揮發(fā)油的得率為考察指標,進行單因素實驗。

1.2.3.1 液料比對陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率的影響 精密稱取5.0000 g瞿麥粉末于三角瓶中,將微波功率調(diào)至300 W,在30 ℃的條件下,微波輔助提取6 min,考察不同液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g)對瞿麥樣品中揮發(fā)油得率的影響。

1.2.3.2 提取溫度對陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率的影響 精密稱取5.0000 g瞿麥粉末于三角瓶中,設(shè)定提取液料比20∶1 mL/g,在微波功率為300 W的條件下提取6 min,考察不同提取溫度(30、35、40、45、50 ℃)對瞿麥樣品中揮發(fā)油得率的影響。

1.2.3.3 提取時間對陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率的影響 精密稱取5.000 g瞿麥粉末于三角瓶中,設(shè)定提取液料比20∶1 mL/g,在微波功率為300 W、提取溫度為45 ℃的條件下,考察不同提取時間(3、4、6、8、10、12 min)對瞿麥樣品中揮發(fā)油得率的影響。

1.2.3.4 微波功率對陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率的影響 精密稱取5.0000 g瞿麥粉末于三角瓶中,設(shè)定液料比為20∶1 mL/g,溫度45 ℃,提取時間為6 min,考察微波功率分別為(300、400、500、600、700 W)時對瞿麥樣品中揮發(fā)油得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,根據(jù)響應(yīng)面 Box-Behnken設(shè)計原理,以液料比、功率、溫度為自變量,瞿麥揮發(fā)油得率為響應(yīng)值,采用3因子3水平的響應(yīng)面分析法,利用Design Expert 10.0.7統(tǒng)計分析軟件建立回歸模型,確定提取瞿麥中揮發(fā)油的最佳工藝參數(shù)。試驗因素設(shè)計如表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率的測定 按照1.2.1的提取方法,精密稱定提取得到的揮發(fā)油質(zhì)量,計算揮發(fā)油得率,其計算公式為:

陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率(%)=B/A×100

式中：A:瞿麥粉末的質(zhì)量;B:揮發(fā)油的質(zhì)量。

1.2.6 瞿麥中揮發(fā)油體外抗氧化活性實驗 在優(yōu)選出最優(yōu)工藝基礎(chǔ)上,對微波輔助提取得到的瞿麥中的揮發(fā)油,和同等條件下超聲(功率120 W)輔助提取得到的瞿麥中揮發(fā)油的抗氧化活性與BHT的抗氧化活性進行對比實驗。

1.2.6.1 DPPH·清除率的測定 采用比色法測定瞿麥中揮發(fā)油的清除DPPH·的能力[11-12]。分別將微波輔助提取和超聲輔助提取的揮發(fā)油用少量的正己烷溶解,配成不同濃度梯度的瞿麥揮發(fā)油溶液,取不同濃度的瞿麥揮發(fā)油溶液2.0 mL,置于10 mL具塞比色管中,加入3.0 mL預(yù)先配制好的0.04 mg/mL DPPH·溶液,常溫避光反應(yīng)30 min,在波長(517 nm)處測定瞿麥揮發(fā)油的吸光值A(chǔ)實驗;將3.0 mL正己烷加到2.0 mL不同濃度的瞿麥揮發(fā)油樣品中做樣品對照,測其吸光值A(chǔ)對照;將2.0 mL正己烷加到3.0 mL的DPPH·溶液中作空白對照,測其吸光度A空白,BHT做陽性對照,每個樣品進行三次平行實驗,取平均值,計算清除率。

清除率(%)=[A空白-(A實驗-A對照)]/A空白×100

清除率(%)=(A空白-A實驗)/A空白×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗結(jié)果均做三次平行實驗,采用SPSS Statistics 17.0計算平均值、標準偏差及抗氧化實驗的IC50值,響應(yīng)曲面的數(shù)據(jù)采用Design Expert 10.0.7分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率的影響

由圖1可以看出,乙醚作為溶劑提取瞿麥中的揮發(fā)油時得率最高,正己烷次之,揮發(fā)油得率最低的是石油醚。但是考慮到乙醚的沸點較低(沸點為34.6 ℃),易揮發(fā),溶劑不容易回收,因此用沸點較高的正己烷(沸點69 ℃)作為提取溶劑。

圖1 溶劑對揮發(fā)油得率的影響Fig.1 Effect of solvents on yield of volatile oil

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 液料比對陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率的影響 由圖2可知,揮發(fā)油的得率在液料比為20∶1 mL/g之前,隨著液料比的增加而逐漸上升,這可能是因為揮發(fā)油的浸出受溶劑用量的影響,導(dǎo)致藥材內(nèi)外部之間提取成分溶液產(chǎn)生濃度差,有利于揮發(fā)油發(fā)生傳質(zhì)過程,快速溶出。在液料比較低時,短時間內(nèi)揮發(fā)油的溶出達到平衡,不利于揮發(fā)油的進一步溶出,但液料比太大時受溶解度的約束作用變小,且溶劑用量過多導(dǎo)致后續(xù)蒸發(fā)困難[14]。因此,確定液料比為20∶1 mL/g。

圖2 液料比對揮發(fā)油得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-material ratios on yield of volatile oil

2.2.2 提取溫度對陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率的影響 由圖3可知,當溫度升高時,提取的瞿麥中揮發(fā)油的得率逐漸上升,當提取溫度達到45 ℃時揮發(fā)油得率達到最高值,之后呈現(xiàn)下降的趨勢,這可能是由于隨著提取溫度升高,細胞內(nèi)部壓力超過了細胞壁膨脹的能力,致使細胞破裂,導(dǎo)致?lián)]發(fā)油自由流出,被周圍溶劑溶解,使揮發(fā)油的提取得率逐漸升高,但隨著溫度繼續(xù)上升,導(dǎo)致部分有效成分揮發(fā)或降解,得率反而下降。所以提取溫度選擇45 ℃較為合適。

2.2.3 提取時間對陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率的影響 由圖4可知,隨著提取時間的增加揮發(fā)油得率呈先增加后減小的變化趨勢,但從圖中揮發(fā)油得率的變化數(shù)值來看,揮發(fā)油的得率隨時間的增加變化不大,當提取時間為6 min時揮發(fā)油得率最高。這可能是因為微波輻射作用加速了被萃取物有效成分向萃取溶劑界面擴散,因而在一定時間內(nèi)揮發(fā)油的得率會呈現(xiàn)升高的趨勢,但在其它條件不變的情況下,隨著時間的延長,瞿麥中的揮發(fā)油可能逐漸被提取完全,因此揮發(fā)油的得率變化不大,將提取過程中提取時間確定為6 min,在后續(xù)響應(yīng)曲面法優(yōu)選最佳提取工藝時不再考察提取時間。

圖4 微波時間對揮發(fā)油得率的影響Fig.4 Effect of microwave time on the yield of volatile oil

2.2.4 微波功率對陜產(chǎn)瞿麥揮發(fā)油得率的影響 由圖5可知,當微波功率增加時,瞿麥中揮發(fā)油的得率逐漸上升,當功微波率達到500 W時揮發(fā)油的得率達到最高,之后隨微波功率的增加揮發(fā)油的得率逐漸下降,其原因可能是,這可能是因為當微波輻射功率越大時,越有利于被萃取物有效成分向萃取溶劑界面擴散,因此,當功率增大時會使揮發(fā)油的得率增大,但微波功率增大的同時,溶劑的溫度也隨之升高,在高溫下一部分揮發(fā)油被揮發(fā),從而使其提取率下降[6]。因此微波功率選擇500 W。

圖5 微波功率對揮發(fā)油得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on the yield of volatile oil

2.3 響應(yīng)曲面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,以液料比(A)、微波功率(B)、提取溫度(C)三個因素為自變量,瞿麥揮發(fā)油得率為響應(yīng)值,利用Design Expert 10.0.7分析軟件,采用三因素三水平的響應(yīng)曲面法優(yōu)化瞿麥中揮發(fā)油的提取工藝,實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果Table 2 Results of response surface optimization experiment

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型建立與分析 用Design Expert 10.0.7統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析,分析結(jié)果見表3。經(jīng)擬合得到的三元二次回歸方程為:

揮發(fā)油得率=-56.20375+0.86095A+0.062400B+1.56095C-6.05000E-004AB+2.60000E-003AC-5.50000E-005BC-0.017280A2-4.94500E-005B2-0.017280C2

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析 根據(jù)Design Expert 10.0.7統(tǒng)計分析軟件可得到響應(yīng)曲面3D圖與等高圖曲線見圖6～圖8。圖6～圖8直觀地反映出各因素之間交互作用對陜產(chǎn)瞿麥中揮發(fā)油提取率的影響。響應(yīng)曲面3D圖中曲線的彎曲度反應(yīng)了因素對響應(yīng)值的影響,彎曲度越大影響越顯著。等高圖的形狀反應(yīng)了兩因素交互作用對響應(yīng)值的影響,等高圖為圓形表示不顯著,橢圓形時表示顯著[16]。圖6表示在最佳提取溫度條件下,液料比和微波功率兩因素的交互作用對陜產(chǎn)瞿麥中揮發(fā)油得率的影響。圖中液料比的曲線較為平緩,表明液料比對提取率的影響較弱,微波功率較液料比對提取率的影響較強,等高線圖為橢圓形說明微波功率與液料比交互作用對揮發(fā)油得率的影響較為極為顯著,與方差分析結(jié)果一致。當液料比在20∶1 mL/g、微波功率為500 W附近時,揮發(fā)油的得率較大。圖7表示在最佳微波功率條件下,液料比和提取溫度兩因素的交互作用對陜產(chǎn)瞿麥中揮發(fā)油得率的影響。圖中液料比的曲線較提取溫度平緩,表明提取溫度對揮發(fā)油得率的影響較液料比更顯著。當液料比在20∶1 mL/g、提取溫度為45 ℃附近時,揮發(fā)油的得率較大。圖8表示在最佳液料比的條件下,微波功率和提取溫度兩因素的交互作用對陜產(chǎn)瞿麥中揮發(fā)油得率的影響。圖中提取溫度的曲線較提取微波功率平緩,表明微波功率對揮發(fā)油得率的影響較提取溫度更顯著,隨著微波功率的升高揮發(fā)油的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當微波功率在500 W、提取溫度為45 ℃附近時,揮發(fā)油的得率較大,與方差分析結(jié)果一致。

圖6 液料比和微波功率交互作用對揮發(fā)油得率的影響Fig.6 Effect of interaction of liquid-to-material ratio and microwave power on volatile oil yield

圖8 微波功率和提取溫度交互作用對揮發(fā)油得率的影響Fig.8 Effect of Interaction between microwave power and extraction temperature on volatile oil yield

2.3.4 驗證試驗 求導(dǎo)回歸方程,得到響應(yīng)曲面法優(yōu)化陜產(chǎn)瞿麥中揮發(fā)油提取工藝的條件為:微波功率483.713 W,液料比19.8954∶1 mL/g,提取溫度45.8905 ℃,理論預(yù)測揮發(fā)油得率為3.27%。考慮到實際實驗情況,工藝條件修正為:微波功率500 W,液料比20∶1 mL/g,提取溫度46 ℃,在此實驗條件下進行三次平行實驗,測定揮發(fā)油得率,三次結(jié)果的平均值為3.19%±0.46%。與模型預(yù)測值總體吻合,說明此模型能較好地預(yù)測陜產(chǎn)瞿麥中揮發(fā)油的得率,用響應(yīng)曲面法優(yōu)化出的工藝是合理可靠的。

2.4 瞿麥揮發(fā)油抗氧化活性的研究

2.4.1 清除DPPH·的測定結(jié)果 DPPH·是具有單電子的穩(wěn)定自由基,當將具有氧化性的物質(zhì)加到體系中時,該物質(zhì)就會和DPPH·的單電子配對,使其吸光度值減小,計算清除率,進而判斷抗氧化活性的大小[11]。此方法被國內(nèi)外廣泛用于天然抗氧化劑的篩選,圖9的變化趨勢顯示了通過微波輔助提取得到的瞿麥中揮發(fā)油和超聲輔助提取得到的瞿麥中揮發(fā)油清除DPPH·的能力強弱,并以BHT作為對照。陜產(chǎn)瞿麥中的揮發(fā)油對DPPH·的清除能力在實驗范圍內(nèi)與濃度呈較好的量效關(guān)系。濃度在0.4～0.9 mg/mL之間,超聲輔助提取和微波輔助提取得到的揮發(fā)油對DPPH·的清除率迅速上升,清除率分別達到了60.08%和51.12%。但濃度在0.9 mg/mL之后,超聲輔助提取得到的揮發(fā)油對DPPH·的清除率變化緩慢,而微波輔助提取得到揮發(fā)油對DPPH·的清除率繼續(xù)上升,直到濃度到達1.0 mg/mL,清除率達到61.02%時,數(shù)據(jù)變化才趨于平緩,但最終兩種不同提取方法得到揮發(fā)油對DPPH·的清除率相當。清除DPPH·能力的大小通常用半清除率(IC50)表示,IC50是當清除率達到50%時所需要的抗氧劑濃度[13],超聲輔助提取得到的揮發(fā)油的IC50值為0.73 mg/mL,微波輔助提取得到的揮發(fā)油的IC50值為0.82 mg/mL。說明超聲輔助提取得到的揮發(fā)油比微波輔助提取得到的揮發(fā)油對DPPH·的清除能力強。另外,兩種不同提取方式獲得的揮發(fā)油對DPPH·的清除率均低于BHT對DPPH·的清除率。說明陜產(chǎn)瞿麥中的揮發(fā)油對DPPH·有一定的清除能力,但沒有BHT的清除能力強。

圖9 不同提取方法揮發(fā)油對DPPH·的清除能力的影響Fig.9 Effect of volatile oil extracted by different methods on DPPH· scavenging ability

圖10 不同提取方法揮發(fā)油對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.10 Effect of volatile oils extracted by different methods on superoxide anion radicals scavenging ability

3 結(jié)論

通過響應(yīng)曲面法對微波輔助提取陜產(chǎn)瞿麥中的揮發(fā)油進行了條件的優(yōu)選,建立了合理可靠的回歸模型,其模型優(yōu)選出的微波提取陜產(chǎn)瞿麥中揮發(fā)油的最優(yōu)工藝:微波功率500 W,液料比20∶1 mL/g,提取溫度 46 ℃,在此實驗條件下得到的揮發(fā)油得率可達3.19%±0.46%,與模型預(yù)測的基本相符。

陜產(chǎn)瞿麥中的揮發(fā)油對DPPH·具有一定的清除能力,從半抑制濃度IC50值來看,超聲輔助提取得到的揮發(fā)油的IC50值為0.73 mg/mL,微波輔助提取得到的揮發(fā)油的IC50值為0.82 mg/mL。說明超聲輔助提取得到的揮發(fā)油對DPPH·自由基的清除能力略大于微波輔助提取得到的揮發(fā)油。

對于以上抗氧化實驗的結(jié)果,究其原因可能與兩種不同的提取方法的機制有關(guān)。超聲輔助提取法是利用超聲波穿透強的優(yōu)勢,利用擊碎、擴散、機械振動等簡單物理方法,達到提取分離目的的物理破碎過程。微波輔助提取法是利用微波能的離子遷移和偶極子轉(zhuǎn)動而引起分子運動,同時,微波能能直接作用到細胞內(nèi)部,極性不同的分子吸收微波能力的不同,可使基體物質(zhì)的某些組分被選擇性加熱,使被萃取物質(zhì)從基體或體系中分離，從而導(dǎo)致兩種方式提取得到的揮發(fā)油的結(jié)構(gòu)或極性略有不同,對不同自由基的清除能力不同。因此,在評價中草藥的抗氧化活性時,應(yīng)采用多種提取方法及多種抗氧化活性評價方法進行綜合評判。