楊會，曾紅霞，張娜，任儉，湯謐，李煜華，陳偉，熊建順，孫玉宏

（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，430345）

葉片是植物進(jìn)行光合作用、呼吸作用及蒸騰作用的主要場所和重要器官，直接影響糖分的積累，其與植株生長勢、營養(yǎng)供應(yīng)、產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等密切相關(guān)[1～3]，且葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)在植物逆境脅迫應(yīng)答中具有重要作用。高等植物成熟葉片是由葉原基頂端分生組織周圍區(qū)起始，在一系列基因精確調(diào)控下，建立近-遠(yuǎn)軸（離植物莖稈較近的一面為近軸，離植物莖稈較遠(yuǎn)的一面為遠(yuǎn)軸）、基-頂軸（葉片基部葉柄到葉片的尖端）和中-側(cè)軸極性（葉脈中軸指向葉片邊緣的結(jié)構(gòu)），朝著特定的方向分裂和分化而形成。葉片發(fā)育過程除受遺傳因子調(diào)控外，還受光照、溫度和水分等外部環(huán)境因素的影響[4，5]。植物葉片形狀多樣化，但無論是單葉還是復(fù)葉，其形態(tài)建成都包括葉原基的發(fā)育、葉片極性的建立、葉片大小和葉形的調(diào)控。

1 葉原基的起始發(fā)育

葉發(fā)育起始于莖頂端分生組織 （shoot apical meristem，SAM），是植物葉片形成發(fā)育的初早期階段。通過對擬南芥、金魚草和玉米等的一系列研究，人們揭示了葉原基在SAM周圍區(qū)發(fā)育的機(jī)制，主要是很多重要的功能基因相互協(xié)調(diào)表達(dá)共同調(diào)控的作用[6]。生長素主要是通過輸入載體AUXI（Auxin Resistant）和輸出載體 PIN1（Pin-For-Med1）對其極性運(yùn)輸進(jìn)行調(diào)控，在葉發(fā)育起始部位SAM周圍區(qū)聚集著高濃度的生長素，通過抑制KNOX基因的活性進(jìn)而促進(jìn)葉原基發(fā)育[7～9]。

KNOX基因是頂端分生組織功能中重要的調(diào)控因子。KNOX1基因的高表達(dá)，可維持SAM處于分生組織形態(tài)，是SAM的特征之一。STM（SHOOT MERISTEMLESS）的stm突變體，SAM停止生長，但是能夠從愈傷組織或SAM部位中形成葉片[10]。ARP基因中的PHAN、RS2（ROUGH SHEATH 2）和AS1（ASYMMETRICLEAVES 1）通過抑制KNOX基因的表達(dá)，參與調(diào)控葉原基的起始發(fā)育。AS1基因表達(dá)于葉片表皮細(xì)胞和莖頂端分生組織，當(dāng)AS1基因功能缺失時，葉片的發(fā)育則出現(xiàn)各種形態(tài)效應(yīng)[11]。另外，KNOX1通過IPT7正向調(diào)控細(xì)胞分裂素的合成，并通過抑制GA20ox的活性負(fù)調(diào)控赤霉素的生物合成，從而調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的進(jìn)程，形成新器官[8]。

2 葉片極性的建立

葉片在基因和環(huán)境因子的協(xié)調(diào)作用下，形成近-遠(yuǎn)軸、基-頂軸和中-側(cè)軸極性3個不對稱軸的過程，即葉片極性的建立[12]。

近年來，葉片的近遠(yuǎn)軸性成為研究的熱點(diǎn)。該研究最早見于 1998 年，Waites等[13，14]從金魚草（Antirrhinum majus） phantastica（phan）突變體中克隆分離出與葉軸面分化相關(guān)的編碼MYB類蛋白的基因PHAN。研究表明，HD-ZIPⅢ基因家族中的PHB、PHV和REV基因，相互協(xié)調(diào)共同調(diào)控SAM細(xì)胞分裂向近軸面表達(dá)分化[15，16]。擬南芥AS1和AS2基因與金魚草中的PHAN基因同源，其中AS1在葉近軸面表達(dá)，AS2則在葉近、遠(yuǎn)軸面交界的內(nèi)側(cè)表達(dá)[12]。在葉遠(yuǎn)軸化的發(fā)育過程中，KANADI基因家族、YABBY基因家族、AUXIN RESPONSIVE FACTOR（ARF）和miRNA165/166起著重要的作用。KAN基因家族中有4個功能冗余基因 （KAN1～KAN4），只有KAN1、KAN2和KAN3參與調(diào)控葉遠(yuǎn)軸面的發(fā)育過程[17，18]。KAN家族基因單缺突變體，缺陷表型表現(xiàn)無或不明顯；而kan1 kan2雙缺突變或kan1 kan2 kan3三缺突變體，缺陷表型為明顯的遠(yuǎn)軸特性[19，20]。擬南芥中有6個YABBY基因，其中只有FIL、YAB2、YAB3和YAB5在葉原基遠(yuǎn)軸面和葉片邊緣區(qū)進(jìn)行表達(dá)[21]。

葉片極性建成過程中，基因之間存在協(xié)同促進(jìn)作用和拮抗作用。參與調(diào)控遠(yuǎn)軸化的KAN基因與決定近軸化的HD-ZIPⅢ基因形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)[22]，KAN1還通過與AS2基因中含有KAN1轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合，進(jìn)而抑制AS2基因在遠(yuǎn)軸面的表達(dá)[23]。AS1/AS2既可正向調(diào)控HD-ZIPⅢ，又可負(fù)調(diào)控YAB[12,24]。KAN和ARF可正調(diào)控YAB，YAB亦能反饋促進(jìn)KAN和ARF表達(dá)[20，25～27]。 異位表達(dá)miR165/166能抑制近軸面基因HD-ZIPⅢ，使葉片發(fā)生遠(yuǎn)軸化[28]。AEGONAUTE10（AGO10）與miR165/166-HD-ZIPⅢ基因的極性分布有關(guān)，可特異性識別結(jié)合miR165/166，并行使其抑制功能，從而參與調(diào)控葉片極性建成[29]。擬南芥Ta-siRNA中TAS3編碼產(chǎn)生的tasiR-ARF可直接負(fù)調(diào)控ARF3和ARF4基因[30]，且AEGONAUTE1（AGO1）也可通過作用于miR165/166，對HD-ZIPⅢ轉(zhuǎn)錄物降解進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而負(fù)調(diào)控HD-ZIPⅢ家族基因的表達(dá)，改變?nèi)~的軸性[31]。

3 葉片大小的調(diào)控

葉片的大小與細(xì)胞增殖與擴(kuò)大的能力有關(guān)，受植物激素、TCP基因、GRF基因、miR396等調(diào)節(jié)因子的影響。

植物激素中的生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素和脫落酸，均可影響植物葉大小發(fā)育。生長素能誘導(dǎo)AUXIN-REGULATEDGENEINVOLVEDIN ORGANSIZE（ARGOS）基因的表達(dá)。擬南芥中，ARGOS基因的表達(dá)水平改變，會直接影響葉的大??；ARGOS基因過表達(dá)時可以葉片變大，下調(diào)時葉片則會減小[32]。綠蘿同時施用生長素和細(xì)胞分裂素時，能夠增加其葉片的厚度和葉肉層，研究表明，細(xì)胞分裂素的調(diào)控途徑可能與生長素調(diào)控植物葉生長的途徑類似[33]。赤霉素通過GA20ox1的作用影響葉大小，ga20ox1突變體相較于野生型而言葉面積明顯減少，而擬南芥aba2突變體與野生型相比，細(xì)胞數(shù)量減少，葉片顯著變小[34]。

TCP基因家族參與葉發(fā)育途徑的調(diào)控，對細(xì)胞的增殖與分化發(fā)揮著重要作用。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的差異，TCP蛋白分為2類：Ⅰ類，促進(jìn)細(xì)胞增殖和植物生長，如水稻OsTCP12；Ⅱ類，抑制細(xì)胞增殖，如水稻OsTCP1[6]。

在擬南芥GRF基因家族中有9個成員，它們通過冗余的方式調(diào)控細(xì)胞增殖促進(jìn)葉的生長發(fā)育。過表達(dá)GRF1和GRF2表現(xiàn)為葉顯著增大，而GRF1/2/3三突變體表現(xiàn)為葉明顯變小[35]。過表達(dá)GRF5促進(jìn)細(xì)胞數(shù)目增多[8]，在ans突變體中，GRF5被下調(diào)，過表達(dá)AN3細(xì)胞數(shù)目增多、葉片增大，而ans缺失時會減緩細(xì)胞增殖速率[36]。

在擬南芥和水稻的葉發(fā)育過程中，miR396負(fù)調(diào)控TCP4和GRF的表達(dá)，而miR319抑制TCP4的表達(dá)[37，38]。

4 葉形的調(diào)控

植物葉形的豐富多樣性，主要體現(xiàn)在葉邊緣形態(tài)的多樣性，可分為全緣、鋸齒狀、不同程度和不同形狀的缺刻等。葉形性狀是在復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用下形成的，涉及眾多因子。

在生長素輸出途徑中，生長素的流動積累方向與PIN1在細(xì)胞膜上的極性定位方向一致，并在生長素高濃度匯聚點(diǎn)形成了葉齒[39，40]。研究發(fā)現(xiàn)，矮牽牛 （Petunia hybida）中的一類轉(zhuǎn)錄因子NAM（NO APICAL MERISTEM）能夠調(diào)控PIN1的極性定位，進(jìn)而參與決定植物葉緣形態(tài)的建成[41]。CUC1（CUPSHAPED COTYLEDON 1）和CUC2（CUP-SHAPED COTYLEDON 2）為擬南芥中NAM的直系同源基因，CUC3則為旁系同源基因，其中CUC2決定葉片發(fā)育早期齒的形成，CUC3維持和保證齒的生長發(fā)育，即兩者均在葉齒之間凹陷處表達(dá)，而CUC1則對葉緣不起調(diào)控作用[42～46]。在葉發(fā)育過程中，MIR164對CUC2的表達(dá)量進(jìn)行負(fù)調(diào)控，從而影響葉緣形態(tài)的建立。在擬南芥的miR164突變體中，降低miR164表達(dá)量時，CUC2表達(dá)量反而升高，此時葉片缺刻加深[44]；過表達(dá)MIR164時，CUC2表達(dá)量反而降低，此時葉片為全緣葉[47]。

KNOX家族基因?qū)χ参锶~緣形態(tài)發(fā)育起著非常重要的調(diào)控作用。具有全緣無缺刻葉的擬南芥中，未發(fā)現(xiàn)KNOX1基因表達(dá)；而在很多具羽狀復(fù)葉或缺刻葉的物種，葉片中均可檢測到KNOX的表達(dá)[48～50]。研究表明，KNOX基因表達(dá)異常時能引起葉緣形態(tài)的強(qiáng)烈變化。在擬南芥La突變體和中as1突變體均發(fā)現(xiàn)KNOX基因過表達(dá)時，葉緣缺刻會增多；在碎米芥中過表達(dá)KNOX基因時，小葉增加，而降低STM（KNOX基因家族成員）表達(dá)量時，抑制小葉發(fā)育，嚴(yán)重時形成單葉[9,51，52]。 另外，KNOX基因以負(fù)調(diào)控赤霉素的合成基因或促進(jìn)細(xì)胞分裂素生物合成的方式，調(diào)控激素之間的平衡，進(jìn)而控制葉緣形態(tài)的發(fā)育[51，53]。 研究發(fā)現(xiàn)，JLO（JAGGED LATERAL ORGANS）、JAG（JAGGED）、SAWTOOTH和Tf（Trifoliate）等也可通過KNOX途徑影響葉緣形態(tài)發(fā)育[54]。

5 研究展望

近年來，隨著對擬南芥葉片發(fā)育研究的不斷深入，初步得到葉發(fā)育過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。植物葉發(fā)育是一個有序而復(fù)雜的過程。目前，對葉片的近遠(yuǎn)軸性的研究較為深入，而葉片極性建立中的中邊軸性和基頂軸性的建立均有待深入的研究。植物葉片的多樣性和唯一性與環(huán)境息息相關(guān)，即使是同一植物其葉片也有可能存在很大差異。以葉片為經(jīng)濟(jì)性狀的植物，葉片的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，是該植物育種的主要目標(biāo)；另一些植物，可以通過改變?nèi)~片形狀、著生角度等調(diào)整株型，提高光能利用率，從而達(dá)到高產(chǎn)的目的。因此，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)等手段進(jìn)一步深入研究葉發(fā)育分子遺傳機(jī)制，不僅能完善葉發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還能在植物育種上開辟新的方式。