哈斯高娃，烏日罕，伊茹汗，唐斯嘎，韓烏蘭圖雅，娜仁花

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018）

幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，駱駝一直是沙漠地區(qū)的重要?jiǎng)游?，大型和小型駱駝科?dòng)物在干旱地區(qū)或高原地區(qū)上發(fā)揮著重要作用。因?yàn)樗軌蛟趪?yán)酷、炎熱以及干燥的環(huán)境中提供奶，肉類(lèi)以及運(yùn)輸。駱駝科包含舊世界駱駝屬和新世界駱駝屬，舊世界駱駝包括兩種：?jiǎn)畏羼橊労碗p峰駱駝[1]，新世界駱駝屬分為駝羊、羊駝、原駝和駱馬[2]。單峰駱駝在北非、阿拉伯和南亞的炎熱干燥氣候的環(huán)境中生長(zhǎng)，而雙峰駱駝在更寒冷的地區(qū)發(fā)現(xiàn)，如俄羅斯南部、中國(guó)和蒙古。駱駝生長(zhǎng)緩慢，比其他牲畜物種更晚到達(dá)青春期,雙峰駱駝母駝3歲性成熟。公、母駱駝混群放牧?xí)r，4歲的母駱駝才能產(chǎn)羔。適宜的配種年齡為4～5歲，繁殖年齡為18～20歲。母駱駝發(fā)情期集中在冬、春兩季。 發(fā)情期在12月下旬到第2年1月中旬[3]，駱駝的妊娠期為390 d，平均出生體重35～40 kg[4]。駱駝在天然牧場(chǎng)條件下的繁殖效率很低，也是影響駱駝生產(chǎn)力的重要因素之一。繁殖效率低的原因包括繁殖季節(jié)相對(duì)較短，進(jìn)入青春期比較晚和13個(gè)月的長(zhǎng)妊娠期。駱駝的繁殖壽命比其他物種長(zhǎng)，并且其生育能力會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)和因?yàn)榘l(fā)病而下降。

1 駱駝卵巢卵泡動(dòng)力學(xué)

對(duì)卵泡生長(zhǎng)階段精確的定義有助于更好了解家畜生殖周期。駱駝是誘導(dǎo)性排卵動(dòng)物,在非懷孕的生殖周期中沒(méi)有黃體[5]。其排卵是在交配后24～48 h后開(kāi)始的。在繁殖季節(jié)，駱駝卵巢卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育以及卵母細(xì)胞的產(chǎn)量都較高，小、中、大卵巢以及卵巢卵泡總數(shù)在繁殖期間高于非繁殖季節(jié)[6]。在成年駱駝中，卵巢具有蠶豆的形狀，長(zhǎng)2 cm，寬1.5 cm。 子宮是雙角的，但與其他反芻動(dòng)物不同的是，因?yàn)樽訉m角短，缺乏典型的子宮子葉[7]。駱駝不育的最常見(jiàn)原因是卵巢發(fā)育不全，病情可能是單側(cè)或雙側(cè)卵巢發(fā)育不全，卵巢雙側(cè)發(fā)育不全的駱駝將沒(méi)有原始卵泡，因此是沒(méi)有生育功能的[8]。據(jù)Smesbah等人報(bào)道，單峰駱駝的每個(gè)卵巢的卵泡平均數(shù)（±SD）是11.57±7.45，小于4歲為9.11±5.74，大于4歲為12.18±7.72。每個(gè)卵巢2～4 mm卵泡的平均數(shù)量在小于等于4歲時(shí)為8.75±5.80,大于4歲時(shí)的單峰駱駝卵巢卵泡數(shù)為11.67±7.38[9]。單峰駱駝卵巢卵泡波可為四個(gè)階段，招募階段、生長(zhǎng)階段、成熟階段以及回歸階段。在招募階段平均招募12個(gè)卵泡。卵泡的生長(zhǎng)階段是卵泡招募后進(jìn)行，3～6個(gè)卵泡長(zhǎng)到約8 mm直徑 （持續(xù)時(shí)間：6.10±0.15 d）。成熟階段由一個(gè)或兩個(gè)生長(zhǎng)的卵泡成為優(yōu)勢(shì)卵泡（持續(xù)時(shí)間：10.20±0.47 d）時(shí)開(kāi)始，并在優(yōu)勢(shì)卵泡（DF）失去其優(yōu)勢(shì)并排卵，下一個(gè)卵泡波出現(xiàn)時(shí)結(jié)束[10]。

評(píng)估雌性駱駝的卵巢狀況可以通過(guò)直腸觸診或通過(guò)超聲檢查。早先在單峰駱駝中了解卵泡波模式是基于少數(shù)動(dòng)物的驗(yàn)尸檢查和直腸觸診。據(jù)研究結(jié)果報(bào)告，在非交配情況下優(yōu)勢(shì)卵泡的壽命，即從卵泡首次出現(xiàn)時(shí)到卵泡消退時(shí)的天數(shù)為，印度的17～23 d[11]，埃及24 d[12]，在蘇丹28 d[5]。在雙峰駝中，平均優(yōu)勢(shì)卵泡壽命為19 d（14～21 d）[13]。在駝羊中，小卵泡每天生長(zhǎng)0.5～1.0 mm，直到它們直徑達(dá)到1.0 cm，然后通常只有一個(gè)卵泡繼續(xù)生長(zhǎng)成為優(yōu)勢(shì)卵泡，而其他卵泡則會(huì)退化[14]。在單峰駱駝和雙峰駱駝中，優(yōu)勢(shì)卵泡的平均最大直徑為2.0±0.1 cm，但在單峰駱駝的大約50%的發(fā)情周期中，優(yōu)勢(shì)卵泡繼續(xù)生長(zhǎng)至直徑為4.2±0.2 cm[15]。這包括從形成優(yōu)勢(shì)卵泡并且能夠排卵，到?jīng)]有交配時(shí)的時(shí)間，它開(kāi)始退化。

將雌性駱駝與雄性一起飼養(yǎng)，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡的直徑為1.3±0.2 cm，小于非交配駱駝的1.5～2.5 cm優(yōu)勢(shì)卵泡時(shí)，它們通常會(huì)交配[16]。在交配的駱駝中，通過(guò)快速檢測(cè)，排卵交配后28～36 h內(nèi)成熟卵泡消失。可以鑒定發(fā)育的黃體（CL）在交配后第4～5 d通過(guò)超聲檢查的到，到第8～9 d時(shí)尺寸最大，黃體會(huì)在第9～12 d退化[17,18]。

2 駱駝卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)

體外卵母細(xì)胞成熟在輔助生殖技術(shù)（ART）中起著至關(guān)重要的作用。核成熟，包括排出第一極體（1PB），細(xì)胞質(zhì)成熟和卵丘細(xì)胞（CC）擴(kuò)增是卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）的標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)報(bào)道，在繁殖季節(jié)單峰駱駝的卵母細(xì)胞的成熟率為68.2%，而在非繁殖季節(jié)卵母細(xì)胞成熟率降至44.4%[19]。Russo等人用熒光共聚焦在單峰駱駝卵母細(xì)胞中觀察生物能和氧化狀態(tài)，其與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂階段有關(guān)。在IVM后，61%的卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，36%的卵母細(xì)胞達(dá)到減數(shù)分裂II期（MII）。在生發(fā)泡（GV）階段未成熟卵母細(xì)胞線粒體聚集體均勻分布，與GV期卵母細(xì)胞相比，MI和MII卵母細(xì)胞在皮質(zhì)周管狀網(wǎng)絡(luò)（PCTN）中顯示更高的線粒體分布率，MI和MII卵母細(xì)胞中的線粒體活性也增加了。MI和MII期卵母細(xì)胞的活性氧（ROS）水平也比GV期卵母細(xì)胞顯著增加[20]。

據(jù)報(bào)道，駱駝卵母細(xì)胞可以在30 h的最佳培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)體外成熟。將培養(yǎng)時(shí)間從36 h延長(zhǎng)至48 h導(dǎo)致卵母細(xì)胞退化。駱駝卵母細(xì)胞處于竇卵泡的生發(fā)泡階段時(shí)，卵母細(xì)胞的成熟將處于第一次減數(shù)分裂的前期I。GVBD所需的時(shí)間從不到6 h連續(xù)到30 h[21]。據(jù)報(bào)道，在培養(yǎng)單峰駱駝卵丘卵母細(xì)胞時(shí)，觀察到從培養(yǎng)的第12 h開(kāi)始會(huì)排出第一極體（6.35%），在48 h期間，觀察到在288個(gè)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物（COCs）中排出63個(gè)第一極體（21.88%），在24 h時(shí)觀察到第一極體排出最高速率（25.40%）[9]。

據(jù)報(bào)道，卵巢卵泡大小對(duì)單峰駱駝的卵母細(xì)胞質(zhì)量是有影響的。Khatir等人通過(guò)體外和體內(nèi)的發(fā)育能力來(lái)衡量卵母細(xì)胞質(zhì)量，COCs的體外成熟（IVM），體外受精（IVF）和體外培養(yǎng)（IVC）后，來(lái)自大卵泡的卵母細(xì)胞卵裂率比小卵泡的更高。來(lái)自小卵泡的囊胚沒(méi)有一個(gè)導(dǎo)致懷孕，而68%（15/22）的來(lái)自大卵泡的胚胎發(fā)育成25 d的妊娠。 在由此產(chǎn)生的15例妊娠中，53%（n=8）中止妊娠（5例2個(gè)月和4個(gè)月之間，3例在懷孕5～7個(gè)月之間）。 剩下的7名懷孕雌性駱駝生下了正常健康的后代（4峰雌性和 3 峰雄性）[22]。

3 雌性駱駝卵泡周期的激素水平變化

與其他駱駝科觀察結(jié)果一致的是，在美洲駝中，黃體溶解始于排卵后第7 d，并在第10 d完成黃體溶解[23]。在單峰駱駝血漿中，促黃體生成素（LH）濃度在交配后1 h內(nèi)增加，2～3 h后達(dá)到最大濃度3～19 ng/mL，然后在交配后6 h開(kāi)始減少[18]。在雙峰駝中，在交配后約4 hLH濃度約為6.9 ng/mL，然后在8 h后LH的濃度會(huì)減少[24]。在人工授精與自然交配的雙峰駱駝中，排卵后雌二醇-17β的濃度立即降低，而排卵后3 d再次上升，在排卵后13 d當(dāng)懷孕開(kāi)始時(shí)，雌二醇濃度再次下降[25]。

Skidmore等人報(bào)道，可以通過(guò)GnRH或hCG以及自然交配誘導(dǎo)使單峰駱駝排卵，用促性腺激素釋放激素（GnRH）或人絨毛膜促性腺激素（hCG）處理的最佳時(shí)間是當(dāng)生長(zhǎng)的卵泡直徑在0.9和1.9 cm之間時(shí)[26]。

在單峰駱駝的發(fā)情周期期間，雌二醇（E2）的濃度會(huì)有一定的變化。 發(fā)情周期的長(zhǎng)度為17.2 d，在妊娠第10個(gè)月，E2水平突然上升并持續(xù)上升至第12個(gè)月，然后激素濃度下降直至分娩當(dāng)天。 非繁殖季節(jié)（5月至11月）的E2水平較低[27]。在發(fā)情周期中，隨著卵巢卵泡大小的增加，雌激素與睪酮濃度也會(huì)上升，然后其濃度隨著卵泡的消退而減少[28]。

隨著卵泡大小的增加，卵泡液中膽固醇濃度也顯著增加。卵泡膽固醇來(lái)自?xún)蓚€(gè)來(lái)源，即卵泡顆粒細(xì)胞中的乙酸鹽和血漿中的脂蛋白[29]。顆粒細(xì)胞在其生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中需要膽固醇[30]。

在已懷孕的單峰駝中，攜帶雄性胎兒的駱駝的孕酮水平高于攜帶雌性胎兒的駱駝水平，而雌二醇濃度低于攜帶雌性胎兒的駱駝水平。由此可見(jiàn)，在單峰駱駝中類(lèi)固醇激素水平受到胎兒性別的影響[31]。

Ararooti等人經(jīng)過(guò)給單峰駱駝注射FSH、eCG-FSH和 hMG后觀察其超數(shù)排卵反應(yīng)，隔12～15 d注射兩次GnRH類(lèi)藥物使單峰駱駝的卵泡波同步，在GnRH類(lèi)藥物處理后2 d后，每3峰駱駝組成的組，接受不同的超數(shù)排卵方案，分別使用促卵泡素（FSH），馬絨毛膜促性腺激素(eCG)和FSH，人絕經(jīng)期促性腺激素（hMG）對(duì)單峰駱駝進(jìn)行超數(shù)排卵，每天注射兩次，連續(xù)注射5 d并逐漸減少劑量，在最后一次注射的36 h后交配一次并靜脈注射GnRH類(lèi)藥物，通過(guò)超聲檢查評(píng)估超數(shù)排卵后第4 d卵巢卵泡的直徑和數(shù)量≥4mm，交配后第7.5 d的黃體和卵泡總數(shù)≥9 mm，觀察到FSH，eCG-FSH和hMG中的黃體總數(shù)與FSH，eCG-FSH和hMG處理的單峰駱駝中擴(kuò)大的孵化囊胚的數(shù)量之間沒(méi)有顯著差異。這項(xiàng)研究表明，三種超排卵方案都可以在單峰駱駝中成功使用并互相替換[32]。

4 駝卵巢囊腫

雌性駱駝的繁殖性能和不孕的原因也包括卵巢異常。Dawod等人收集非妊娠期的雌性駱駝的（n=500）的卵巢，在繁殖和非繁殖季節(jié)期間檢查，粗略地測(cè)量卵巢卵泡的直徑并記錄卵巢異常。駱駝卵泡囊腫通常在單側(cè)或雙側(cè)有單個(gè)或多個(gè)囊腫，大多數(shù)是單一的。 囊腫是薄壁的，血管良好或略微不透明，并充滿(mǎn)稻草色卵泡液。 直徑范圍為17～40 mm。卵巢黃體囊腫則是厚壁的，變得部分或完全不透明，接近灰黃色。抽吸后卵泡液達(dá)到22 mL。黃體囊腫的大小可以達(dá)到50 mm的直徑。出血性囊腫是單層，厚壁，長(zhǎng)在卵巢單側(cè)或雙側(cè)，并且在抽吸后含有血液卵泡液達(dá)到8 mL。直徑范圍為10～25 mm[33]。

卵巢卵泡、黃體和出血性囊腫是非排卵卵泡（功能性囊腫）的正常進(jìn)化。 這些囊腫的存在表明排卵失敗可能是由于交配后LH釋放不足引起的[15]。LH釋放不足可能是由于下丘腦-垂體功能紊亂或減少交配刺激的作用。

5 體外成熟以及體外受精

與其他物種一樣，輔助生殖技術(shù)（ART）在駱駝科動(dòng)物中也非常重要，ART可以更有效地利用優(yōu)越遺傳基因的雄性，幫助預(yù)防駱駝性病傳播，減少動(dòng)物運(yùn)輸?shù)男枰?。體外成熟（IVM）和體外受精（IVF）的目標(biāo)是產(chǎn)生大量?jī)?yōu)質(zhì)的胚胎和這些胚胎在轉(zhuǎn)移到受體動(dòng)物后能夠成功活產(chǎn)。與其他一些大型家畜相比，關(guān)于駱駝科動(dòng)物的IVM和IVF的報(bào)道很少。

與其他動(dòng)物物種相比，駱駝科動(dòng)物的體外胚胎生產(chǎn)效率不高，將卵巢儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)12 h而不會(huì)對(duì)體外卵母細(xì)胞成熟產(chǎn)生有害影響的能力對(duì)于長(zhǎng)距離運(yùn)輸有很大幫助，但是更多的研究需要集中在通過(guò)超聲波引導(dǎo)卵子采集（OPU），如?；蚱渌倚笪锓N來(lái)收集活體動(dòng)物的卵母細(xì)胞。

駱駝的人工授精需要誘導(dǎo)排卵，因?yàn)轳橊勈钦T導(dǎo)排卵的。由于排卵發(fā)生在GnRH注射后的28～36 h，人工授精的最佳時(shí)間被認(rèn)為是用GnRH處理后24 h，然而研究表明，在GnRH注射的同時(shí)也進(jìn)行了人工授精懷孕結(jié)果為55%。初步研究表明，受孕需要多達(dá)300×106個(gè)活精子，但是最近的研究表明，子宮體內(nèi)150×106活精子或僅80×106位于含有優(yōu)勢(shì)卵泡的卵巢的子宮角尖端，兩者的妊娠率均為40%～50%[34]。稀釋的精液可以在4℃下儲(chǔ)存24 h，如果24 h后的運(yùn)動(dòng)性至少可以達(dá)到為35%～40%，則可以進(jìn)行人工授精。 然而，使用新鮮精液可獲得55%的懷孕率，但使用冷卻的精液可將懷孕率降低至約25%[35]。

使用前列腺素合成酶抑制劑甲氯芬那酸也可以延長(zhǎng)駱駝的黃體壽命。如果從排卵后第7 d開(kāi)始口服甲氯芬那酸，直至胚胎移植后7 d，并在排卵后第8 d、10 d或12 d轉(zhuǎn)移胚胎，妊娠率分別達(dá)到80%，60%和70%的妊娠率，而未用甲氯芬那酸處理的第8 d的對(duì)照組的妊娠率為10%[36]。

種間胚胎移植也是一種可用于保護(hù)瀕危物種的方法。Niasari等人首次報(bào)道了舊世界駱駝科植物種間胚胎移植的第一份報(bào)告，首次單峰駱駝出生的雙峰駝犢的成果。Niasari等人使用FSH遞減劑量的方法處理一峰雙峰駝超數(shù)排卵6 d，然后在第7 d單次注射FSH。每天進(jìn)行卵巢超聲檢查直至大多數(shù)生長(zhǎng)的卵泡達(dá)到13～17 mm的大小并成熟，并相隔24 h，與具有生育能力的雄性雙峰駝交配兩次。 在第一次交配時(shí)，給予雌性駱駝20 μg乙基酰胺。在供體駱駝交配后一天，單峰駱駝受體靜脈注射25 mg豬促黃體生成素（LH）誘導(dǎo)排卵。在第一次交配后第8.5 d回收胚胎，并在LH注射后第7.5 d胚胎移植到受體中。胚胎移植后25 d診斷為妊娠。在分娩時(shí)出生的健康的雙峰駱駝并沒(méi)有任何特殊的并發(fā)癥（例如難產(chǎn)和新生兒疾?。37]。

6 結(jié) 語(yǔ)

目前，有關(guān)駱駝卵泡發(fā)育以及排卵的相關(guān)報(bào)道不多，需要更多的研究來(lái)了解雌性駱駝的卵巢、卵泡發(fā)生以及排卵的動(dòng)力學(xué)有利于提高駱駝繁殖率。在駱駝的產(chǎn)犢間隔很長(zhǎng)、繁殖季節(jié)比較短、性成熟晚等情況下，提高駱駝繁殖效率仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。 迫切需要通過(guò)使用激素處理和卵巢超聲波掃描來(lái)一致和準(zhǔn)確地控制卵泡波生長(zhǎng)周期和閉鎖。 還應(yīng)嘗試促進(jìn)青春期的開(kāi)始，縮短產(chǎn)后間隔至受孕并在繁殖季節(jié)之外誘導(dǎo)排卵。種間胚胎移植提供了一種至關(guān)重要的方法，可以保護(hù)瀕臨滅絕的駱駝科動(dòng)物免受滅絕的威脅，也可以在不引入活體動(dòng)物的情況下將新種駱駝科植物引入其他國(guó)家。