李美鶯 章麗潔 陳燕君 沈儉 戴莉

摘 要 隨著超聲分子成像技術的飛速發(fā)展，超聲聯(lián)合微泡（空化效應聯(lián)合微泡）成為生物醫(yī)學的研究熱點，應用前景廣闊，有望成為一種新的安全、無創(chuàng)的治療手段。目前，腫瘤治療陷入瓶頸，如何根據(jù)現(xiàn)有技術及藥物提高治療效果是臨床一線醫(yī)師的重要課題。全文闡述超聲對比劑和空化效應的發(fā)展以及超聲聯(lián)合微泡技術載送腫瘤藥物、靶向超聲微泡介導基因、超聲和微泡聯(lián)合化療藥物治療腫瘤、對腫瘤血管抑制及誘導腫瘤細胞凋亡等的研究進展。

關鍵詞 腫瘤；超聲空化；微泡對比劑；靶向

中圖分類號：R445.1 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）02-0026-05

Research progress of ultrasound combined with microvesicle technology in the treatment of tumors

LI Meiying， ZHANG Lijie， CHEN Yanjun， SHEN Jian， DAI Li

（Putuo Hospital affiliated to Traditional Chinese Medicine University of Shanghai 200062， China）

ABSTRACT With the rapid development of ultrasonic molecular imaging technology， ultrasound combined with microbubbles （cavitations combined with microbubbles） has become a research hotspot in biomedicine， its application prospect is broad and it is expected to become a new safe and non-invasive treatment. At present， cancer treatment is in a bottleneck， and how to improve the therapeutic effect is an important topic for clinical frontline physicians according to the existing technology and drugs. The full text explains the development of ultrasound contrast agents and cavitations effects and advances in research on ultrasound combined with microbubble technology to carry tumor drugs， targeted ultrasound microbubble-mediated genes， ultrasound and microbubbles combined with chemotherapy drugs to treat tumors， tumor angiogenesis and induction of apoptosis in tumor cells.

KEY WORDS tumour； ultrasonic cavitations； microbubble contrast agent； targeting

隨著超聲分子成像技術的飛速發(fā)展，超聲聯(lián)合微泡（空化效應聯(lián)合微泡）成為生物醫(yī)學的研究熱點，應用前景廣闊，有望成為一種新的安全、無創(chuàng)的治療手段。目前，腫瘤治療陷入瓶頸，如何根據(jù)現(xiàn)有技術及藥物提高治療效果是臨床一線醫(yī)師的重要課題。本文闡述超聲對比劑和空化效應的發(fā)展以及超聲聯(lián)合微泡技術在腫瘤治療中的應用及效果。

1 超聲對比劑的發(fā)展

超聲對比劑指嚴格制成的、對人體無毒害的氣體微泡， 通過氣泡對超聲波背向散射而達到增加超聲回波信號，進而提高超聲成像分辨本領的技術。利用超聲對比劑可提高超聲成像對生物體特定疾病的診斷率。理想的對比劑應具備以下條件[1-2]：①粒徑小。微泡粒徑太大不能透過毛細血管，容易造成血管堵塞。②半衰期長，體內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定好。超聲診斷需要一定的時間，這要求微泡對比劑在體內(nèi)有足夠的穩(wěn)定性以保證診斷過程中不破裂。③外殼柔軟且富有彈性，在低用量時即可得到良好的超聲成像效果。泡膜越厚彈性越差，需要更高頻率超聲使微泡共振，因此產(chǎn)生血管破裂或組織淤血的可能性越大。④生物相容性好，不良反應少，制備方法簡單，儲存方便。

隨著納米技術和生物學技術的迅猛發(fā)展，超聲對比劑正向著納米級和靶向修飾的方向發(fā)展。納米級超聲對比劑較常規(guī)對比劑的優(yōu)勢在于具有極強的穿透力，有可能到達血管外實現(xiàn)超聲靶向顯像[3]。納米級超聲對比劑的開發(fā)和應用使血池外成像和超聲分子影像學成為可能。由于腫瘤宿主固有血管（該部分血管通透正常）最大孔徑≤100 nm，腫瘤新生微血管孔徑可達380 ～780 nm，納米級超聲對比劑粒徑小于700 nm，可輕松通過腫瘤新生血管孔徑，在腫瘤組織中聚集，實現(xiàn)超聲成像[4]。另外，隨著微泡尺寸的減小，物質(zhì)的分子特性會發(fā)生很大的改變，表現(xiàn)出如表面張力增大、表面活性中心增多、吸附能力增強、不易受體內(nèi)和細胞內(nèi)各種酶的降解等特性，還可將超聲對比劑與特異性配體連接或作為藥物、基因的載體，利用超聲波與對比劑的相互作用及所產(chǎn)生的生物學效應實現(xiàn)腫瘤的靶向診斷和治療。

2 空化效應

空化效應指通過外加能量使液體內(nèi)的氣核被拉開成空化氣泡的現(xiàn)象?？栈且环N閾效應，超聲空化閾值與液體中微氣泡（即空化核）的存在、數(shù)量及濃度密切相關。超聲微泡對比劑作為人造空化核進入機體后可顯著增強空化效應，其機制主要有兩方面：①因為人體內(nèi)幾乎不含氣核，因此外加微泡可顯著增加外源性空化核數(shù)量，進而增加空化效應的強度。②降低超聲的空化閾值。微泡存在可減少產(chǎn)生空化所需的總能量，并降低引起空化效應的能量閾值。Ward等[5]利用超聲聯(lián)合微泡作用于淋巴細胞懸浮液，發(fā)現(xiàn)當超聲輻照劑量一定而注入微泡濃度增高或微泡濃度不變而超聲輻照劑量增加，可出現(xiàn)兩種聲孔效應，一種是細胞膜上出現(xiàn)暫時性開放小孔，小孔關閉后，細胞能保持活性，稱為可恢復性或可逆的聲孔效應；另一種是細胞膜上形成永久開放小孔，細胞可能會喪失活性，稱為致死性或不可逆的聲孔效應。因此，超聲聯(lián)合微泡產(chǎn)生的可控性空化效應在治療領域中前景廣闊。

3 超聲聯(lián)合微泡治療腫瘤

3.1 超聲聯(lián)合微泡介導基因及藥物

近年來，超聲聯(lián)合對比劑介導基因或藥物靶向治療異軍突起，這是一種“不開刀、不留瘢痕、沒有損傷”的新的“狙擊療法”[6]。Tinkov等[7]提出利用超聲破壞微泡實現(xiàn)藥物向目標組織轉(zhuǎn)移釋放，從而起到靶向治療的效果。此法可提高局部藥物濃度，同時避免藥物受到外部環(huán)境破壞，延緩藥物釋放，保持藥物原有的代謝性質(zhì)及降低外源性藥物引起的毒副作用和免疫反應等。超聲微泡還可作為載體運送細胞毒性藥物，并在超聲作用下破壞微泡實現(xiàn)藥物向目標組織釋放，從而起到靶向治療的作用。已有研究證明了微泡靶向給藥效果，將微泡填充藥物作為載體傳送癌癥藥物給腫瘤體，微泡受超聲激勵后破裂，其產(chǎn)生的物理效應對腫瘤具有一定破壞作用。同時，藥物釋放時可瞬時增加細胞滲透性，導致藥物僅在局部釋放，從而減少對身體的毒副作用[8-9]，最大限度地提高治療效果。Zhang等[10]用多西紫杉醇脂質(zhì)微泡聯(lián)合超聲觸發(fā)微泡破壞，減少腫瘤細胞增殖，誘導MHC-H細胞凋亡，顯著抑制小鼠實體瘤的生長，表明用超聲輻照載有抗腫瘤藥物的微泡能明顯提高藥物的治療功效。

微泡是一種無創(chuàng)、高效的新型基因載體，基因在到達病變組織前遇到的主要屏障是內(nèi)皮屏障和細胞膜。研究表明，超聲波破壞微泡后可引起直徑≤700 nm的微血管破裂，內(nèi)皮細胞間隙增寬，使基因等更容易通過血管內(nèi)皮到達靶組織并被吸收[11]。靶向超聲微泡介導基因（miRNA）超聲微泡對比劑是以糖類、磷脂、白蛋白、高分子多聚物等物質(zhì)為殼膜，包含有不同氣體的球狀物質(zhì)[12-13]。王玲[14]采用載基因熒光金微泡聯(lián)合US/NIR雙模態(tài)成像、雙輻照-光熱-基因治療肝癌及其機制的研究為微泡對比劑攜帶抑癌基因治療腫瘤提供了實驗基礎。Ji等[15]將載有miRNA-133a的超聲微泡注入乳腺癌小鼠體內(nèi)，通過抑制表皮生長因子（EGF）表達和Akt磷酸化抑制細胞增殖，使腫瘤生長受到抑制，提高了小鼠生存率。Chowdhury等[16]將miR-122和miR-21抑制劑聯(lián)合高分子微泡-脂質(zhì)體復合物（PLGA-NP）作用于離體肝細胞肝癌（HCC）細胞和在體HCC異種移植瘤，結(jié)果表明兩種miRNA聯(lián)合較單一miRNA治療效果更好，并可導致對多柔比星有耐藥性的HCC細胞死亡，為提高腫瘤基因治療效果以及對化學藥物產(chǎn)生抗性的腫瘤的治療提供了新的思路和方法。超聲微泡介導的基因轉(zhuǎn)染為靶向基因治療提供了很好的平臺，能精確地將基因作用于靶器官，減少侵襲性，提高轉(zhuǎn)染效率。

3.2 超聲微泡聯(lián)合藥物治療腫瘤

喬學研等[17]的研究表明低能量診斷超聲（MI=0.3）聯(lián)合微泡可以增強兔VX2的血流灌注，而高能量診斷超聲（MI=1.4）可減少血流灌注，但均不會對組織產(chǎn)生明顯的結(jié)構(gòu)性變化，此規(guī)律可為臨床工作中多種腫瘤的治療提供可靠依據(jù)，也為超聲聯(lián)合微泡治療腫瘤提供依據(jù)。仇春麗等[18]用超聲介導自制納米微泡聯(lián)合順鉑對小鼠皮下H22腫瘤的抑制研究表明，超聲微泡聯(lián)合藥物組比超聲微泡組及單純藥物組的抑瘤效果更佳，抑瘤率達70.01%。超聲微泡聯(lián)合藥物具有協(xié)同抗腫瘤效應，其機制可能是通過抑制腫瘤新生血管生成和誘導腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。同時，超聲輻照聯(lián)合微泡能增強化療藥的藥理作用，抑制瘤體生長。Sonoda等[19]將黑色素瘤B-16細胞接種于嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠下眼瞼皮下制成腫瘤模型，并采用三種方法進行治療，結(jié)果表明單純博來霉素組即使劑量達到2 mg/ml，腫瘤還能逐漸生長，博來霉素+超聲輻照組的博來霉素劑量為0.25 mg/ ml時，腫瘤生長受抑制，超聲輻照+白蛋白微泡組的博來霉素劑量為0.06 mg/ml時即能抑制腫瘤生長，認為超聲聯(lián)合微泡輻照能顯著減少藥物用量，提高化療效果。

3.3 超聲聯(lián)合微泡阻斷腫瘤血管或抑制腫瘤血管化研究

目前，微血管密度測定技術已公認為評價腫瘤新生血管形成的“金標準”[20-21]。腫瘤新生血管結(jié)構(gòu)簡單，缺乏彈力纖維層，具有管壁薄弱、基底膜不完整和通透性高等特點[22]。超聲空化效應可引起微血管的血管內(nèi)皮細胞機械性損傷、基底膜斷裂、膠原蛋白暴露，導致微血栓形成，栓塞或部分阻斷已形成的腫瘤血管的局部血液循環(huán)和血液供應，使微血管密度減低，引起局部腫瘤細胞死亡，進而使腫瘤體積縮小，控制腫瘤進展，達到治療目的（圖1）[23]。Lawrie等[24]報道超聲輻照可使裸露DNA對血管內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染率提高l0倍，使質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染效率提高3倍。如在空化條件下使用微泡與質(zhì)粒結(jié)合，則比單純裸質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率提高300倍，如果空化下使用的微泡是脂質(zhì)體微泡，則基因轉(zhuǎn)染效率將比單純裸質(zhì)粒基因的轉(zhuǎn)染效率提高3 000倍。Taniyama等[25]用編碼熒光素的質(zhì)粒DNA體外轉(zhuǎn)染人血管平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞，24 h后單純質(zhì)粒組細胞熒光素活性較低，超聲照射組比單純質(zhì)粒組高約70倍，對比劑+超聲照射組比單純質(zhì)粒組高7 000～8 000倍；活體實驗中質(zhì)粒+對比劑+超聲照射組比單純質(zhì)粒組細胞的熒光素活性高約1 000倍。Willmann等[26]的研究表明，超聲空化在微血管栓塞中能起到至關重要的作用，空化作用可破壞癌組織的微血管管壁和部分周圍組織，激發(fā)凝血酶活性，引發(fā)大面積毛細血管形成血栓，從而切斷腫瘤組織的血液供給途徑。簡蓉等[27]用超聲結(jié)合微泡（靜脈注射微泡）在15只昆明小白鼠的左后側(cè)小腿皮下種植S180肉瘤細胞，結(jié)果表明腫瘤及腫瘤周圍組織在微泡注射后超聲顯影均有明顯增強，但腫瘤組織在治療下即刻血流灌注明顯減少，部分區(qū)域在治療后24 h未能恢復，而腫瘤周圍組織在治療后即刻血流灌注稍有減少，在治療后24 h明顯恢復，證實低強度超聲聯(lián)合微泡通過對腫瘤及腫痛周圍組織產(chǎn)生不同組織病理學改變繼而引起差異性的血流灌注影響，而造成兩者對超聲空化產(chǎn)生不同病理反應的潛在機制是兩者血管之間的成熟度差異。黃品同等[28]將17只血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（VEFGR2）高表達的結(jié)腸癌皮下種植瘤Balb/C裸鼠模型分為三組，A組5只為對照組，僅接受超聲造影檢查和假照射；B組6只用空白脂質(zhì)微泡結(jié)合超聲輻照；C組6只用載靶向VEGFR2單抗的脂質(zhì)微泡結(jié)合超聲輻照，所有模型均用紅色熒光蛋白標記，空化治療前和治療后1周分別進行超聲造影和熒光攝片檢查，測量腫塊大小、熒光面積、熒光強度及血管密度，并進行比較，結(jié)果表明微泡及靶向微泡均能增強超聲去空化對腫瘤細胞的損傷和對腫瘤滋養(yǎng)血管的栓塞作用，但靶向微泡去空化效果更佳。

腫瘤的“饑餓療法”是治療無手術切除指征或術后復發(fā)腫瘤患者的首選方案，但由于受器械和操作手法限制，對于直接營養(yǎng)腫瘤的大量滋養(yǎng)血管往往束手無策。用超聲破壞微泡可使腫瘤新生血管發(fā)生明顯超微結(jié)構(gòu)改變，引起內(nèi)皮細胞線粒體腫脹、髓樣變、細胞質(zhì)空化等，為微泡對比劑直接治療腫瘤提供了新方法。趙璐等[29]用低強度脈沖超聲輻照K562白血病細胞，并聯(lián)合Sonovue增強超聲空化效應，結(jié)果微泡參與的超聲空化能直接開放mPTP，并通過CsA介導通路釋放Cytc，最終導致凋亡發(fā)生。吳曉輝等[30]用不同強度的低頻超聲聯(lián)合微泡對膠質(zhì)瘤進行治療，并從組織學、免疫組化、透射電鏡等不同層面觀察其微結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果顯示不同劑量的低強度超聲對膠質(zhì)瘤細胞的增殖均有抑制作用，并隨超聲輻射增強而增強，在0.7 W/cm2超聲輻照后細胞凋亡率最高，輻射細胞在透射電鏡下能看見細胞褶皺、DNA斷裂、線粒體腫脹甚至空泡化等凋亡的典型改變（圖2）。體外研究證實超聲空化效應可以增加細胞膜的通透性，降低細胞的遷移能力和增殖能力，可以作為藥物或載體控釋手段定位增加病變部位溫度，而正常組織不會受到損傷，從而增加化療藥物敏感性，對腫瘤細胞的遷移能力有明顯的抑制作用。

4 總結(jié)及展望

隨著超聲分子成像的飛速發(fā)展，超聲聯(lián)合微泡輻照在腫瘤治療中有巨大的潛力，為臨床腫瘤治療提供了新的可供選擇的思路。空化效應是超聲輻照微泡介導基因轉(zhuǎn)染的主要機制，但同時亦能產(chǎn)生有害的生物學效應，只有適宜的超聲參數(shù)和納/微泡劑量才能在不損傷細胞的前提下促進基因轉(zhuǎn)染。目前，動物實驗已證實納/微泡可作為基因的輸送載體進行基因治療，超聲聯(lián)合微泡在動物實驗中的研究進展相對迅速，超聲靶向微泡破壞技術介導的靶向基因治療方法既可增強裸質(zhì)粒DNA在癌細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染和表達，又能提高基因治療的靶向性，減少全身不良反應，超聲微泡聯(lián)合藥物也有很多相關研究，因此，超聲聯(lián)合微泡是一種很有前途的臨床腫瘤治療技術。但相關研究似乎未能與臨床取得一致，若用于臨床尚需要大量研究評價其效果和安全性。

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