林麗 李楊瑞 安千里

（1. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，南寧 530007；2. 浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，杭州 310058）

實現(xiàn)非豆科主糧作物自主利用生物固氮，滿足作物生長發(fā)育的氮素營養(yǎng)需求，是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的重要目標(biāo)。實現(xiàn)這一目標(biāo)主要有3條途徑：改造非豆科作物和根瘤菌而形成有效根瘤共生固氮；將原核生物的固氮酶系統(tǒng)導(dǎo)入植物細(xì)胞的葉綠體或線粒體，使非豆科作物自主固氮；利用或優(yōu)化自然界存在的高效非豆科植物聯(lián)合固氮系統(tǒng)［1］。聯(lián)合固氮（Associative nitrogen fixation）是指自生固氮菌定殖于植物體表或體內(nèi)，從植物體表分泌物和植物體內(nèi)獲得能源，在氧濃度適合的微環(huán)境中固氮，為植物提供氮素，與植物互惠共生，但沒有形成像根瘤這樣特異分化的共生固氮器官。本文描述的聯(lián)合固氮包括了Johanna D?bereiner定義的聯(lián)合固氮和內(nèi)生固氮（Endophytic nitrogen fixation）［2］。相應(yīng)地，聯(lián)合固氮菌包括定殖于植物體表的附生固氮菌（Epiphytic diazotrophs）和植物體內(nèi)的內(nèi)生固氮菌（Endophytic diazotrophs）。固氮菌與非豆科植物聯(lián)合固氮為植物提供氮素的水平一般較低。那些植株高大、生物量大，能在貧瘠土壤中常年茂盛生長的禾本科C4植物，如象草、芒草、柳枝稷（Panicum virgatum）和Kallar草（Leptochloa fusca），甚至作物（如甘蔗、玉米和高粱），可能通過高效的生物固氮系統(tǒng)獲得生長所需氮素，因而較早受到研究者的關(guān)注［3-4］。

甘蔗是重要的糖料作物和能源作物，生長周期長，需氮量高。在巴西，很多地區(qū)種植甘蔗通常每年施氮60-70 kg/hm2，而甘蔗積累氮100 kg以上，卻能保持連年高產(chǎn)且土壤肥力不減［5-6］。從20世紀(jì)50年代開始，研究者從巴西甘蔗根際土壤和體內(nèi)分離到多種固氮細(xì)菌，通過乙炔還原乙烯法［7］、15N2-摻入法［8-9］、氮平衡法［6，10-11］、15N 自然豐度法［12-13］和15N稀釋法［6，11］證實了巴西某些甘蔗品種中存在高水平的生物固氮，從生物固氮獲得的氮素最高可達(dá)甘蔗積累氮素的70%［11-12］。

中國是世界第三大產(chǎn)糖國，糖產(chǎn)量的90%來源于甘蔗。中國蔗田一般施氮量是每年400-800 kg/hm2，不僅遠(yuǎn)高于巴西蔗田的施氮量，也高于印度、澳大利亞和美國蔗田的施氮量（150-200 kg/hm2）。過度施肥不僅增加生產(chǎn)成本，而且導(dǎo)致更多氮肥流失，生態(tài)環(huán)境惡化，已成為中國甘蔗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要限制因素［14］。

對巴西甘蔗聯(lián)合固氮菌的研究曾引領(lǐng)了非豆科植物聯(lián)合固氮和植物內(nèi)生細(xì)菌的研究。Baldani等［15-16］回顧了前期關(guān)于巴西甘蔗聯(lián)合固氮的研究。而本文基于巴西甘蔗聯(lián)合固氮研究的經(jīng)驗和近年來甘蔗微生物組學(xué)研究進(jìn)展，探討利用和優(yōu)化甘蔗聯(lián)合固氮的策略，以發(fā)揮生物固氮在中國甘蔗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的作用。

1 奇特的Gluconacetobacter diazotrophicus

Acetobacter diazotrophicus（后分類為Gluconacetobacter diazotrophicus）被 D?bereiner［2］稱為“最奇特的固氮菌”（Most extraordinary diazotroph）。G. diazotrophicus在含10%（W/V）蔗糖、0.5%（V/V）甘蔗汁、pH 5.5（接近甘蔗莖中蔗糖的濃度和pH）的無氮培養(yǎng)基［17-18］中生長良好，在含30%蔗糖的培養(yǎng)基中還能生長［17］。在培養(yǎng)基中含10%蔗糖時，G.diazotrophicus的固氮酶活性對氧、銨、氨基酸及鹽脅迫有較強(qiáng)的耐受能力［19］。G. diazotrophicus不能直接轉(zhuǎn)運和同化蔗糖，通過分泌果聚糖蔗糖酶（Levansucrase，一種果糖基轉(zhuǎn)移酶Fructosyltransferase）水解蔗糖產(chǎn)生葡萄糖和果糖；而且，果聚糖蔗糖酶能催化合成果聚糖，形成胞外多糖限制氧擴(kuò)散，保護(hù)固氮酶在較高氧濃度下固氮［20-21］。G.diazotrophicus能通過增強(qiáng)呼吸來降低固氮酶周圍的氧濃度［22］，通過FeSII蛋白與固氮酶形成復(fù)合體改變固氮酶構(gòu)象，使暫時失活的固氮酶不受胞內(nèi)高濃度氧的傷害［23］。在10%蔗糖下，G. diazotrophicus的銨同化率降低2/3，能在10 mmol/L銨下維持固氮酶活性［19］，而25 mmol/L銨不僅抑制G. diazotrophicus的固氮酶活性，而且誘導(dǎo)部分細(xì)胞變形為長細(xì)胞，轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢膳囵B(yǎng)狀態(tài)［24］。G. diazotrophicus沒有硝酸還原酶，不能還原硝酸鹽，固氮酶活性不受硝酸鹽抑制。G. diazotrophicus在含葡萄糖和蔗糖的培養(yǎng)基中產(chǎn)酸，在pH 2.5還能生長和固氮［17，25］。G.diazotrophicus與裂解淀粉酵母在含10%蔗糖或2%淀粉的無氮培養(yǎng)基中共培養(yǎng)時，固氮酶活性是單獨培養(yǎng)時的2倍，而且將固定氮素的一半轉(zhuǎn)移到了酵母中［26］。這些特性顯示G. diazotrophicus適應(yīng)甘蔗體內(nèi)環(huán)境，能在高糖有氮有氧的條件下固氮，并可能將固定的氮素轉(zhuǎn)給甘蔗細(xì)胞。

G. diazotrophicus的數(shù)量在不同品種甘蔗中有量級上的差異，在同一品種甘蔗的不同生長期也可發(fā)生量級上的變化［24，27-29］。土壤中高水平的化合態(tài)氮抑制G. diazotrophicus在甘蔗中定殖［29-31］。在低氮土壤，甘蔗根、莖和葉中G. diazotrophicus的數(shù)量最高分別可達(dá)每克鮮重 107、106和 107個［5，24，27-28］，在菌量上有可能實現(xiàn)高水平的聯(lián)合固氮。

用G. diazotrophicus野生型菌株和nifD-突變株接種適應(yīng)低氮甘蔗品種SP70-1143的無菌組培苗，野生型和突變株能等量定殖于甘蔗苗和成熟甘蔗，15N2摻入法檢測到接種野生型的甘蔗苗中摻入15N的量顯著高于接種nifD-突變株和不接種的甘蔗苗，而后兩者間沒有顯著差異，表明G. diazotrophicus在甘蔗苗體內(nèi)固氮。在缺氮條件下，接種野生型甘蔗苗的長勢（高度、分蘗數(shù)和葉數(shù)）強(qiáng)于接種nifD-突變株和不接種的甘蔗苗，而且苗中氮總量顯著高于接種nifD-突變株和不接種的甘蔗苗，G. diazotrophicus可能為甘蔗苗生長提供了氮素。在不缺氮條件下，接種野生型和nifD-突變株都能顯著促進(jìn)甘蔗苗生長和積累氮素，其間沒有顯著差異，氮肥可能抑制野生型菌株與甘蔗聯(lián)合固氮，nifD-突變株可能通過固氮外的其他因子促進(jìn)甘蔗生長［32］。用G.diazotrophicusPAL5接種SP70-1143甘蔗組培苗后盆栽12個月，用15N稀釋法測得G. diazotrophicus的固氮率（Ndfa%，nitrogen derived from air）是 9.2%［27］；接種另一個適應(yīng)低氮甘蔗品種RB 867515，從甘蔗根和葉鞘中提取RNA，用RT-PCR擴(kuò)增nifHmRNA并測序cDNA發(fā)現(xiàn)G. diazotrophicus能在葉鞘中表達(dá)nifH［33］。這些證據(jù)表明G. diazotrophicus能與巴西適應(yīng)低氮的甘蔗品種聯(lián)合固氮，但測得聯(lián)合固氮的水平比相應(yīng)甘蔗品種在田間所顯示的生物固氮水平低得多，而且G. diazotrophicus對甘蔗生長的促進(jìn)作用不僅是固氮的貢獻(xiàn)。G. diazotrophicusPAL5能合成吲哚乙酸［34］和赤霉素［35］，可能由此促進(jìn)甘蔗根的伸長和植株的發(fā)育，擴(kuò)展的甘蔗根系能更有效地吸收水分和氮素等營養(yǎng)。

D?bereiner和同事最初僅從甘蔗和含糖量高且行營養(yǎng)繁殖的象草和甘薯體內(nèi)分離到G.diazotrophicus，沒有從甘蔗行間土壤和田間多種雜草的根中分離到，但從侵染甘薯的VA菌根真菌的孢子中［36］和吸食甘蔗汁的甘蔗粉紅粉蚧中分離到G.diazotrophicus［37］，因此認(rèn)為G. diazotrophicus是專性內(nèi)生菌（Obligate endophyte）［38］，在植物體的傳播主要通過植物營養(yǎng)繁殖、VA菌根真菌和粉蚧。后來，從咖啡樹［39-40］、穇子（Eleusine coracana）［41］、菠蘿［42］、胡蘿卜、蘿卜、甜菜［40］和水稻［43］等植物體內(nèi)，從咖啡樹、穇子、水稻和甘蔗的根際土壤中也分離到了G. diazotrophicus［24，39，41，43］。而用G.diazotrophicus接種甘蔗組培苗后，G. diazotrophicus在根際的數(shù)量甚至高于在根內(nèi)的數(shù)量［29］。提高土壤濕度能延長G. diazotrophicus在土壤中的存活時間［44］。總之，G. diazotrophicus適應(yīng)甘蔗體內(nèi)高糖和偏酸環(huán)境，主要通過甘蔗營養(yǎng)繁殖而傳播，但它的生境并不局限在高糖和行營養(yǎng)繁殖植物的體內(nèi)。相應(yīng)地，人們用G. diazotrophicus接種甘蔗以外的作物，如高粱［45］、玉米［46］、菜豆［47］和模式植物擬南芥［48］，以促進(jìn)植物生長并研究其機(jī)理。

Cocking等［49］在含3%蔗糖的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)擬南芥、玉米、水稻、小麥、油菜、番茄和白花三葉草的無菌幼苗，接種約5個細(xì)胞的G.diazotrophicus，讓G. diazotrophicus進(jìn)入了這些植物根分生組織的細(xì)胞，存在于由膜包裹的囊泡內(nèi)，進(jìn)而由根分生組織進(jìn)入根伸長區(qū)細(xì)胞和葉細(xì)胞內(nèi)。G.diazotrophicus可能通過細(xì)胞壁降解酶作用穿過根分生組織細(xì)胞的細(xì)胞壁，在蔗糖誘導(dǎo)的植物細(xì)胞內(nèi)吞作用［50］下進(jìn)入根細(xì)胞。G. diazotrophicus如何從根分生組織實現(xiàn)系統(tǒng)侵染目前還不清楚。用nifH啟動子融合GUS報告基因（nifH-GUS）標(biāo)記的G.diazotrophicus接種植物顯示G. diazotrophicus在植物根細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)nifH-GUS，有可能形成不結(jié)瘤的細(xì)胞內(nèi)共生固氮系統(tǒng)［51］。

自然界中有固氮細(xì)菌與非豆科植物形成了不結(jié)瘤的細(xì)胞內(nèi)共生固氮系統(tǒng)，如Gunnera屬被子植物與念珠藻（Nostoc）屬的固氮藍(lán)細(xì)菌形成了獨特的細(xì)胞內(nèi)共生固氮系統(tǒng)。Nostoc細(xì)菌進(jìn)入Gunnera植物莖上分泌粘液的腺體，在腺體細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中由膜包裹的囊泡中分裂并分化成異形胞。異形胞的由多糖和糖脂形成的雙層被膜能限制氧的擴(kuò)散。異形胞固定的氮素能轉(zhuǎn)給植物，滿足Gunnera植物對氮的需求［51-52］。目前已發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)生細(xì)菌能定殖在植物細(xì)胞內(nèi)，如Thomas等發(fā)現(xiàn)在香蕉和木瓜的細(xì)胞內(nèi)有活的內(nèi)生細(xì)菌［52-53］。固氮菌與植物形成高效的共生固氮系統(tǒng)或許需要細(xì)菌內(nèi)生于植物細(xì)胞，但結(jié)瘤不是共生固氮必須的。Cocking等［49］的操作可能讓G.diazotrophicus與植物的聯(lián)合固氮系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)共生固氮系統(tǒng)，植物細(xì)胞質(zhì)中包裹著固氮菌的囊泡或可演化成固氮細(xì)胞器［51］。G. diazotrophicus與擬南芥或水稻形成的內(nèi)共生系統(tǒng)可作為模式系統(tǒng)用于研究細(xì)菌內(nèi)生于植物細(xì)胞的機(jī)制和建立高效的細(xì)胞內(nèi)共生固氮系統(tǒng)。

2 固氮菌聯(lián)盟（Diazotroph consortium）

巴西甘蔗高水平的聯(lián)合固氮可能是多種固氮菌共同實現(xiàn)的。除了G. diazotrophicus，前期從巴西高固氮品種甘蔗中分離培養(yǎng)的固氮菌主要還有Herbaspirillumseropedicae、H. rubrisubalbicans、Burkholderia tropica（后分類為Paraburkholderia tropica）、Azospirillumlipoferum、A. brasilense和A.amazonense（ 后 分 類 為Nitrospirillum amazonense）等［16］。5個 固 氮 菌 株G. diazotrophicusPAL5、H.seropedicaeHRC54、H. rubrisubalbicansHCC103、N.amazonenseCBAmC和P.tropicaPpe8經(jīng)混合組成“固氮菌聯(lián)盟”接種甘蔗。它們都能合成吲哚乙酸。H.seropedicae和H. rubrisubalbicans還有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶基因［55］，ACC脫氨酶分解植物產(chǎn)生的乙烯合成前體ACC，降低植物在逆境下產(chǎn)生乙烯的水平，從而緩解逆境下植物生長所受的抑制。G. diazotrophicus在蔗糖中產(chǎn)酸，而Herbaspirillum嗜用有機(jī)酸，它們在甘蔗體內(nèi)共處可能穩(wěn)定共棲微環(huán)境的pH。5個菌株都有合成細(xì)菌素（Bacteriocin）的基因，G. diazotrophicusPAL5合成的細(xì)菌素gluconacin在體外能不同程度地抑制多種甘蔗病原細(xì)菌，也能抑制其他G. diazotrophicus菌株、N.amazonenseCBAmC 和P.tropicaPpe8［56］，但大體上，用5個菌株共同接種甘蔗產(chǎn)生了協(xié)同增效的作用。

用N.amazonenseCBAmC和P.tropicaPpe8共同接種SP70-1143甘蔗組培苗后5 d，P.tropicaPpe8的定殖量是N.amazonenseCBAmC的近1 000倍，而用5個菌株共同接種，N.amazonenseCBAmC的定殖量比與P.tropicaPpe8共同接種時提高了100倍［28］。用5個菌株共同接種后7 d，細(xì)菌總數(shù)大于每克鮮重107個，對甘蔗苗的生長產(chǎn)生負(fù)荷，讓甘蔗苗在45 d馴化期的存活率降低；接種后200 d，5個菌株在甘蔗根和地上部的數(shù)量都接近每克鮮重106個，在接種后400 d的甘蔗根中的數(shù)量也接近每克鮮重106個。接種后12個月，5個菌株的聯(lián)合固氮率（29.2%）比單獨接種G. diazotrophicusPAL5（9.2%）、共同接種H.seropedicaeHRC54和H. rubrisubalbicansHCC103（14.6%）、共同接種N.amazonenseCBAmC和P.tropicaPpe8（8.1%）的固氮率高［27］。而且，在不施氮肥的貧瘠土壤中，用“固氮菌聯(lián)盟”接種新植蔗和宿根蔗，都發(fā)生了較高水平的聯(lián)合固氮并增產(chǎn)［57］。

用“固氮菌聯(lián)盟”接種RB 867515和RB 72454甘蔗的三芽種莖，在不施氮、施磷鉀和鉬的土壤中生長，能顯著促進(jìn)甘蔗增產(chǎn)，增產(chǎn)幅度接近施120 kg/hm2N的作用，但無論接種與否，甘蔗都表現(xiàn)出高水平的生物固氮，固氮水平不受接種影響［58］。另一研究用“固氮菌聯(lián)盟”接種RB 867515新苗和每季收獲后的宿根蔗，發(fā)現(xiàn)僅G. diazotrophicusPAL5在接種甘蔗的葉鞘中表達(dá)nifH，P. tropicaPpe8在接種甘蔗的根中表達(dá)nifH；而在不接種不施氮的甘蔗根和葉鞘中，有P. tropica表達(dá)了nifH［33］?？赡苓@5個固氮菌中僅G. diazotrophicus和P. tropica與甘蔗聯(lián)合固氮，或5個固氮菌在不同時間和甘蔗體內(nèi)不同空間聯(lián)合固氮，而不接種的甘蔗中同樣有P. tropica或其他固氮菌在不同時空發(fā)生聯(lián)合固氮。

用“固氮菌聯(lián)盟”接種RB 867515和適應(yīng)中高氮甘蔗品種IACSP95-5000的由種莖催芽獲得的幼苗，能促進(jìn)幼苗生根、增加細(xì)根數(shù)、增加根長、根體積和表面積，增加根干重近50%；但在不施氮、施磷鉀和微量元素的土壤中，無論接種與否，接種單個菌株或組合菌株，兩個品種都表現(xiàn)出高水平的生物固氮，不受接種固氮菌影響［59］。

總之，“固氮菌聯(lián)盟”能協(xié)同促進(jìn)甘蔗的生長，通過產(chǎn)生植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)根的伸長和發(fā)育，提高根吸收水分和氮素等營養(yǎng)，進(jìn)而促進(jìn)甘蔗的生長發(fā)育和抗逆；在低氮土壤中，“固氮菌聯(lián)盟”與某些甘蔗品種聯(lián)合固氮，實現(xiàn)減氮不減產(chǎn)。

3 聯(lián)合固氮根瘤菌

從發(fā)現(xiàn)甘蔗內(nèi)生固氮菌并組合“固氮菌聯(lián)盟”進(jìn)行田間試驗的近20年里，受技術(shù)限制，人們并不清楚哪些固氮菌是巴西甘蔗高水平生物固氮的主要貢獻(xiàn)者。2000年以來應(yīng)用RT-PCR等技術(shù)的研究揭示了固氮菌在不同生境下nifH的表達(dá)水平與固氮水平相符［60-61］。Fischer等［33］發(fā)現(xiàn)“固氮菌聯(lián)盟”接種RB 867515甘蔗后，僅G. diazotrophicus和P.tropica在甘蔗體內(nèi)表達(dá)nifH；發(fā)現(xiàn)Bradyrhizobium在接種和不接種甘蔗的根中、Rhizobium在接種和不接種甘蔗的葉鞘中、Ideonella/Herbaspirillum近緣固氮菌在接種和不接種甘蔗的根和葉鞘中，Methylocapsa在不接種甘蔗根中表達(dá)nifH；而且檢測到非接種固氮菌的nifHcDNA克隆數(shù)量比接種菌株的高。這些非接種固氮菌有可能是巴西甘蔗高水平生物固氮的主要貢獻(xiàn)者。Burbano等［62］發(fā)現(xiàn)在巴西、墨西哥和納米比亞田間甘蔗根部活躍表達(dá)nifH的是Rhizobium rosettiformans的近緣菌，在巴西和墨西哥甘蔗莖中也發(fā)現(xiàn)有Bradyrhizobium屬的細(xì)菌表達(dá)nifH，但沒有發(fā)現(xiàn)“固氮菌聯(lián)盟”中的菌種表達(dá)nifH。在日本Miyako島種植的甘蔗品種NiF8有顯著的生物固氮［12，63-64］。Thaweenut等［64］發(fā) 現(xiàn) NiF8 甘 蔗 僅 在高溫季節(jié)有顯著的生物固氮，用RT-PCR檢測到甘蔗莖和根中有近似Bradyrhizobium屬、Azorhizobium caulinodans、Sinorhizobium fredii、Derxia gummosa和Nostoc commune等細(xì)菌表達(dá)nifH。這些研究揭示在甘蔗體內(nèi)活躍固氮的主力可能是根瘤菌。

在澳大利亞昆士蘭種植的甘蔗（澳大利亞品種 Q186 和 Q208、巴西品種 SP 79-2313）［65］和在云南開遠(yuǎn)種植的甘蔗野生種Saccharum officinarum、S. spontaneum、S. barberi和栽培品種 ROC22［66］的根內(nèi)，豐度最高的固氮菌屬是Bradyrhizobium屬，Rhizobium屬固氮菌的豐度也較高。

Rouws等［67］用豇豆結(jié)瘤誘捕或YMA培養(yǎng)基直接分離，從RB 867515甘蔗的根和莖基部獲得遺傳多樣的Bradyrhizobium屬菌株，其中2個能結(jié)瘤和2個不結(jié)瘤的Bradyrhizobium菌株能在自由培養(yǎng)下表現(xiàn)固氮酶活性，有可能在甘蔗體內(nèi)以不結(jié)瘤的狀態(tài)固氮。

另有研究發(fā)現(xiàn)Bradyrhizobium可能與水稻、甘薯和高粱聯(lián)合固氮。非洲野生稻與合萌屬豆科植物（Aeschynomene sensitiva）一起生長，非洲野生稻中有能與合萌結(jié)瘤的光合Bradyrhizobium細(xì)菌，用野生稻的內(nèi)生Bradyrhizobium菌株和從合萌分離的Bradyrhizobium菌株ORS278接種水稻后能測到固氮酶活性并促進(jìn)水稻生長和結(jié)實［68］。與豆科作物輪作的水稻中有能分別與不同豆科植物結(jié)瘤的光合和非光合Bradyrhizobium細(xì)菌［69］，非光合Bradyrhizobium菌株SUTN9-2在缺氮下與水稻聯(lián)合能表達(dá)nifH［70］。在與花生間作的水稻中發(fā)現(xiàn)了沒有nodABC基因的Bradyrhizobium屬細(xì)菌［71］。甘薯適合在貧瘠土壤中生長并形成塊根。在日本種植的甘薯品種Beniazuma可能從生物固氮獲得約44%的氮素［72］，Beniazuma甘薯的莖和塊根中豐度最高且表達(dá)nifH的固氮菌屬于Bradyrhizobium屬［73］，從表面滅菌的甘薯塊根中分離到的Bradyrhizobium菌株AT1［74］有nif基因簇但沒有nodABC基因［75］，能在自由培養(yǎng)下表現(xiàn)固氮酶活性［74］，用AT1接種無菌的甘薯幼苗增加了甘薯苗的鮮重和氮含量，甘薯葉和莖中的固氮率為10%-14%［74］。在日本福島田間生長的高粱品系KM1和KM2的根在生長后期表現(xiàn)出較高的固氮活性，KM1和KM2根中有較高豐度的與不結(jié)瘤Bradyrhizobium菌株S23321和光合B. oligotrophicum菌株S58T近緣的固氮菌；從高粱根中分離到的Bradyrhizobium中，菌株TM122和TM124沒有nod基因，能在自由培養(yǎng)下表現(xiàn)固氮酶活性；TM122還能在接種高粱種子后，在根中表現(xiàn)固氮酶活性，有可能以不結(jié)瘤方式與高粱聯(lián)合固氮［76］。

Bradyrhizobium屬細(xì)菌在屬分類水平上是全球土壤中最普遍的細(xì)菌［77-78］，也是陸生植物根部相對豐度最高的細(xì)菌［79］，是隨陸生植物共同進(jìn)化的核心細(xì)菌群的重要成員［79］。Bradyrhizobium屬細(xì)菌有較大的基因組，進(jìn)化中基因的獲得和丟失讓Bradyrhizobium具有遺傳多樣性、適應(yīng)多樣的環(huán)境，如有固氮或光合的能力、依賴nod基因或不依賴nod基因與豆科植物結(jié)瘤形成共生固氮系統(tǒng)，也可能與非豆科植物不結(jié)瘤聯(lián)合固氮并成為非豆科植物的核心固氮菌群。

4 甘蔗微生物組

植物微生物組（Microbiome）是與植物共棲的所有微生物及其遺傳信息的集合。植物微生物組中相對數(shù)量較高、能穩(wěn)定持久地與健康植物共棲的微生物被稱為核心微生物菌群（Core microbiota），在維持植物健康生長和生態(tài)功能上發(fā)揮必要作用［80］。核心微生物菌群的分類結(jié)構(gòu)（Taxonomic structure）有一定保守性，但可塑性高。核心微生物菌群的功能結(jié)構(gòu)（Functional structure）比分類結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定和持久，功能結(jié)構(gòu)可以不依賴于分類結(jié)構(gòu)［80-81］。

基于高通量測序16S rRNA基因和nifH基因的不依賴培養(yǎng)的微生物多樣性分析顯示在巴西、澳大利亞和中國種植的不同甘蔗種和品種的聯(lián)合細(xì)菌及固氮菌的多樣性有顯著差異，但共有某些核心菌群［65-66，82-83］。如在澳大利亞的昆士蘭［65］和我國云南［66］種植的不同甘蔗栽培品種和野生種的共有核心菌群中有Chitinophagaceae等8個科的細(xì)菌，核心固氮菌群中都有Bradyrhizobium、Rhizobium和Burkholderia屬的細(xì)菌。曾經(jīng)被重點研究的與巴西甘蔗聯(lián)合的Azospirillum，Herbaspirillum和Gluconacetobacter屬固氮菌僅是巴西種植甘蔗品種SP80-3280核心菌群的次要成員［82］，在昆士蘭［65］和云南［66］種植甘蔗的根中甚至檢測不到Gluconacetobacter屬固氮菌。而在巴西甘蔗中豐度最高的多個核心微生物種類，如Chitinophagaceae科的細(xì)菌，與甘蔗的聯(lián)合還從來沒有被研究過［82］。

澳大利亞田間的甘蔗沒有顯著的生物固氮［84］，甘蔗根的核心細(xì)菌菌群和固氮菌群的分類結(jié)構(gòu)和相對豐度在低氮（40 kg/hm2）和常量氮（160-180 kg/hm2）下沒有顯著差異［65］；增加氮肥對土壤的碳循環(huán)有負(fù)面影響，提高了病原真菌在土壤和根際的豐度［85］；而甘蔗根的核心細(xì)菌菌群可能通過維持分類結(jié)構(gòu)而維持必要功能。

Dong等［66］發(fā)現(xiàn)在施氮 350 kg/hm2下生長的ROC22甘蔗根中Klebsiella屬固氮菌的豐度高于Bradyrhizobium屬。與此相符，Klebsiella屬固氮菌是我們從廣西田間ROC22甘蔗中分離到的優(yōu)勢固氮菌［86］。通過減少氮肥，用大豆和花生與甘蔗間作，能顯著提高甘蔗根際土壤固氮菌的多樣性［87］，提高根際核心固氮菌群中Bradyrhizobium屬的相對豐度［88］；多因子誘導(dǎo)甘蔗聯(lián)合固氮菌群分類結(jié)構(gòu)的改變可能增強(qiáng)甘蔗聯(lián)合固氮。

5 展望

非豆科作物實現(xiàn)聯(lián)合固氮取決于植物和固氮菌雙方的基因型和環(huán)境因素。植物基因型決定植物為固氮菌提供的碳源和其他營養(yǎng)、植物對固氮菌定殖入侵的響應(yīng)和植物吸收氮素的效率。固氮菌基因型決定固氮菌聯(lián)合固氮、促進(jìn)植物生長、定殖于植物和與其他微生物協(xié)作的能力。環(huán)境因素有植物和固氮菌共棲地土壤的碳氮比和含水量、氣候決定的區(qū)域溫度和降水量等因素。

中國甘蔗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展可以借鑒巴西經(jīng)驗：減施化肥；篩選適應(yīng)低氮、氮利用率高且能聯(lián)合固氮的甘蔗品種，如RB 867515（引進(jìn)中國后簡稱B8）［89］；為新植蔗和宿根蔗接種固氮菌或包括固氮菌的合成功能菌群（Synthetic community），讓接種菌與甘蔗緊密聯(lián)合成為核心功能菌群（Functional core microbiota）；在甘蔗苗期施適量氮肥以支持甘蔗苗的生長發(fā)育和光合作用，為功能菌群提供碳源，建立穩(wěn)定聯(lián)合；在甘蔗整個生長期保持充足灌溉，施適量磷鉀肥和鉬肥支持甘蔗聯(lián)合固氮［90］。

構(gòu)建高效的合成功能菌群可改良已有的甘蔗“固氮菌聯(lián)盟”和基于微生物組學(xué)從頭合成甘蔗功能菌群。由5個固氮菌組成的“固氮菌聯(lián)盟”可視為合成功能菌群的雛形?！肮痰?lián)盟”有聯(lián)合甘蔗固氮和提高甘蔗氮素利用率的基本功能，雖可能沒有田間甘蔗原生核心菌群的成員，但通過無菌組培苗與細(xì)菌共培養(yǎng)［91］可將“固氮菌聯(lián)盟”導(dǎo)入甘蔗而建立不依賴甘蔗原生核心菌群的合成功能菌群，通過調(diào)整菌群成員和接種方式可能提高合成功能菌群的效率。調(diào)整“固氮菌聯(lián)盟”成員可增加甘蔗聯(lián)合固氮的原生核心菌群，如Bradyrhizobium屬固氮菌。調(diào)整接種方式如接種很少量的G. diazotrophicus與甘蔗組培苗共培養(yǎng)，誘導(dǎo)G. diazotrophicus進(jìn)入甘蔗細(xì)胞而內(nèi)共生固氮［49］。

在中國田間甘蔗中可能沒有G. diazotrophicus［66］，人工接種可擴(kuò)展G. diazotrophicus的宿主。我們將G. diazotrophicus導(dǎo)入ROC22甘蔗的組培苗，使甘蔗苗從氮氣獲得6.8%的氮素［92］，與ROC22甘蔗的土著固氮菌Klebsiella variicola的聯(lián)合固氮率相當(dāng)［93］。Dent［94］報 告 用G. diazotrophicus制 成 的 菌劑產(chǎn)品NFix?處理玉米和小麥種子，在田間小區(qū)讓不施氮肥和施不同水平氮肥下種植的玉米總體增產(chǎn)8%（830 kg/hm2），讓小麥增產(chǎn) 7%（460 kg/hm2）；NFix?的作用相當(dāng)于給玉米減施27%的氮肥而不減產(chǎn)，給小麥減施61%的氮肥而不減產(chǎn)。NFix?對作物的作用是固氮和其他促植物生長因子的協(xié)同作用。Cocking等［49］接種G. diazotrophicus的技術(shù)可能讓G.diazotrophicus實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)共生固氮，是實現(xiàn)非豆科作物高效固氮的新途徑。目前，還沒有研究揭示甘蔗、甘薯和水稻體內(nèi)功能固氮菌Bradyrhizobium的固氮狀態(tài)，或許Bradyrhizobium也能進(jìn)入非豆科作物細(xì)胞實現(xiàn)內(nèi)共生固氮。

目前已具備基于微生物組學(xué)從頭合成甘蔗功能菌群的技術(shù)。從田間成熟甘蔗植株尤其是從莖中提取DNA和RNA的難度較高，要優(yōu)化多個步驟才能建立不依賴培養(yǎng)的甘蔗微生物組學(xué)方法［33，95］。不依賴培養(yǎng)的微生物多樣性分析已發(fā)現(xiàn)甘蔗各器官的核心微生物菌群［65-66，82］，發(fā)現(xiàn)核心微生物菌群共存網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的樞紐（Hub）微生物［83］?；诰号囵B(yǎng)（Community-based culture collection）的方法［96］結(jié)合96孔板收集可培養(yǎng)微生物和高通量測序兩步擴(kuò)增得到的16S rRNA基因序列，已能獲得和鑒定甘蔗根際核心菌群中15.9%的細(xì)菌和莖稈內(nèi)核心菌群中61.6%-65.3%的細(xì)菌，從中選出了對應(yīng)20個豐度最高可操作分類單元（OTU）的培養(yǎng)物，合成菌群，接種去胚乳的玉米種子，使接種后4周幼苗的干重是不接種對照幼苗的3倍，證實由16S rRNA基因序列高豐度指導(dǎo)合成的核心菌群包括了重要的植物益生菌，能促進(jìn)植物生長［97］。RT-PCR擴(kuò)增nifHmRNA［33，64］結(jié)合高通量測序能確定甘蔗體內(nèi)核心功能固氮菌群（Functional diazotroph community）的組成；用不同配方的半固體無氮培養(yǎng)基分離富集固氮菌［98］，結(jié)合基于菌群培養(yǎng)的方法［96］和定向誘捕的方法［67］可能獲得可培養(yǎng)的核心功能固氮菌群成員，基于nifH表達(dá)量指導(dǎo)合成功能固氮菌群，通過無菌組培苗與細(xì)菌共培養(yǎng)［91］將功能固氮菌群導(dǎo)入甘蔗，用15N稀釋等方法檢驗功能固氮菌群的聯(lián)合固氮功能。用甘蔗組培苗與細(xì)菌共培養(yǎng)建立的實驗體系能用于調(diào)試優(yōu)化合成功能菌群和篩選甘蔗品種，最終建立高效甘蔗-微生物共生體，實現(xiàn)甘蔗高效固氮和利用氮素，促進(jìn)甘蔗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。