羅利

（上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

從1960年代開始，世界范圍內(nèi)的氮肥消耗量增加了13%，現(xiàn)在每年合成量接近100 Tg（Terrogram，1012g）；禾谷類有效利用氮肥的效率由約80%降至約30%，約有60%（每年近1億噸氮肥）流失于陸地和水體環(huán)境，造成土壤板結(jié)、酸化，重金屬離子釋放，導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境問題，威脅農(nóng)林牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。其中，約有40%的氮肥通過反硝化作用轉(zhuǎn)變成氮?dú)饣氐娇諝庵校速M(fèi)了全球能源供應(yīng)的1%；而反硝化過程產(chǎn)生的N2O是一種潛在的溫室氣體，其對全球變暖的危害約是等量CO2的300倍?？梢婇L期大量使用化學(xué)氮肥將對生態(tài)系統(tǒng)平衡和人類社會的可持續(xù)發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。

1 生物固氮作用

在哈珀合成氨技術(shù)發(fā)明之前，自然界的化合態(tài)氮素形成主要通過原核生物（包括細(xì)菌和古菌）的生物固氮作用和閃電或者火山噴發(fā)形成。生物固氮作用即原核生物中的固氮酶系在厭氧或者微氧以及常溫常壓條件下將空氣中單質(zhì)氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨的過程，是自然界化合態(tài)氮素形成的主要途徑。生物固氮作用包括自生、聯(lián)合和共生3種形式。自生固氮作用即固氮微生物在厭氧條件下固定氮素供給自身使用，如念珠藍(lán)細(xì)菌（Nostocsp.）、維氏固氮菌（Azobacter vinelandii）和類芽孢固氮菌（Paenibacillussp.）等。聯(lián)合固氮作用，即固氮微生物生活在一些植物的體表或者組織間隙，利用植物光合產(chǎn)物作為碳源，固定氮素主要供給自己使用，多余的提供給宿主植物，如巴西固氮螺菌等。全球的聯(lián)合固氮細(xì)菌年固氮總量約50-70 Tg。共生固氮作用，即固氮微生物在根瘤器官的植物細(xì)胞中，利用宿主光合產(chǎn)物作為能源，固定氮素支持宿主生長發(fā)育，如根瘤菌-豆科植物、弗蘭克氏菌-榿木和藍(lán)細(xì)菌-澳大利亞蘇鐵等。全球豆科植物-根瘤菌共生固氮作用的年固氮量約21.5 Tg［1］?？梢?，自生和聯(lián)合固氮微生物的固氮總量較共生固氮微生物要高，但是就單一固氮系統(tǒng)的效率和對農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的貢獻(xiàn)而言，共生固氮作用要遠(yuǎn)高于自生和聯(lián)合固氮作用。但是共生固氮系統(tǒng)的主要問題是固氮微生物的宿主專一性，即特定的共生固氮微生物只能侵染特定種屬的宿主植物，不能侵染其它種屬的植物。以苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）為例，其只能侵染苜蓿屬（Medicago）、草木犀屬（Melilotus）和葫蘆巴屬（Trigonella）豆科植物。而廣譜根瘤菌SinorhizobiumNGR234則可以侵染多達(dá)上百種豆科植物，形成固氮根瘤。然而，作為人類主要糧食來源的禾谷類作物如水稻、玉米等，卻不能與固氮細(xì)菌形成共生關(guān)系，依靠共生固氮作用獲得氮源。因此，突破共生固氮細(xì)菌的宿主專一性，在禾谷類糧食作物中合成固氮細(xì)胞器，對農(nóng)業(yè)、環(huán)境和社會的持續(xù)發(fā)展意義巨大。

隨著合成生物學(xué)的興起，以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，以工程學(xué)為指導(dǎo)，將標(biāo)準(zhǔn)化、解偶聯(lián)、模塊化和可組裝性等原則引入遺傳工程研究領(lǐng)域，降低生物系統(tǒng)的多樣性和復(fù)雜性，從而實(shí)現(xiàn)對生物系統(tǒng)（基因遺傳線路）的人工設(shè)計和定向改造。目前，合成生物學(xué)研究已取得突破性進(jìn)展，如成功設(shè)計出了生產(chǎn)青蒿素的酵母細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌基因密碼子的重排和酵母染色體的簡化，化學(xué)合成了細(xì)菌和酵母基因組，合成攜帶最小基因組的衣原體等［2-6］。

近年來，國內(nèi)外的研究者將合成生物學(xué)原理引入了生物固氮研究領(lǐng)域，形成了固氮合成生物學(xué)的新領(lǐng)域，為植物固氮細(xì)胞器的人工合成奠定了基礎(chǔ)。本文就近年來固氮合成生物學(xué)的主要研究進(jìn)展作簡要綜述，并針對相關(guān)問題提出一些看法和設(shè)想。

2 固氮合成生物學(xué)研究進(jìn)展

早期的固氮合成生物學(xué)研究可以追溯到1970年代，研究人員首次將肺炎克氏桿菌（Klebsiella oxytoca）nif基因簇導(dǎo)入大腸桿菌（Escherichia coli），測出了固氮酶活性［7］。最近，Liu等［8］將固氮藍(lán)細(xì)菌Cyanothecesp. ATCC 51142中的35個固氮相關(guān)基因?qū)氩还痰乃{(lán)細(xì)菌Synechocystissp. PCC 6803中，測出了30%的固氮酶活性。同時他們還發(fā)現(xiàn)，通過提高nif基因的表達(dá)量可以增強(qiáng)固氮酶活性；表達(dá)吸氫酶基因則可以提高固氮酶對氧氣的耐受性。

隨著分子遺傳學(xué)的快速發(fā)展，固氮基因的表達(dá)調(diào)控研究取得了重要進(jìn)展，鑒定到了氮調(diào)節(jié)系統(tǒng)NtrB/NtrC、微氧調(diào)節(jié)系統(tǒng)NifL/NifA和FixL/FixJ，特別是固氮正調(diào)節(jié)nifA的特性如溫度敏感性等研究結(jié)果［9-10］，為固氮基因的工程化應(yīng)用提供了理論依據(jù)。20世紀(jì)90年代，研究人員嘗試著在固氮細(xì)菌中異源表達(dá)固氮正調(diào)節(jié)基因nifA，提高固氮效率。中科院上海植生所的沈善炯實(shí)驗(yàn)室成功地構(gòu)建了組成型表達(dá)肺炎克氏桿菌（K.oxytoca）NifA的大豆根瘤菌工程菌株，在隨后的接種實(shí)驗(yàn)中顯示了良好的增產(chǎn)效果［11］。

真正將合成生物學(xué)規(guī)則引入固氮遺傳工程研究始于2012年，Voigt實(shí)驗(yàn)室首先報道了肺炎克氏桿菌（K. oxytoca）固氮基因簇重構(gòu)［12］。他們應(yīng)用自下而上的方法重建了nif基因簇，表明了合成生物學(xué)工具在生物固氮工程化應(yīng)用中的潛力。但是，細(xì)菌固氮基因簇向真核生物的轉(zhuǎn)移，并獲得具備自主固氮能力的作物進(jìn)展并不大。

2.1 固氮酶基因簇的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移及適配性研究

由于固氮酶對氧氣具有極端的敏感性，因此，天然生物固氮系統(tǒng)進(jìn)化出了獨(dú)特的氧保護(hù)機(jī)制。比如固氮藍(lán)細(xì)菌通過空間隔離在異形胞中表達(dá)固氮酶或者在時間上通過生物鐘調(diào)控將光合和固氮作用分開來避免光合作用產(chǎn)生的氧氣對固氮酶的傷害；維氏固氮菌（A. vinelandii）和田菁根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）分別通過海藻酸氧擴(kuò)散屏障作用以及固氮酶與特定的鐵硫蛋白Shetna互作來保護(hù)固氮酶［13-14］；豆科植物固氮根瘤中通過宿主植物表達(dá)的豆血紅蛋白結(jié)合和傳遞氧氣，由于該蛋白對氧氣分子具有極高的親和力，所以共生植物細(xì)胞以及類菌體中氧濃度極低，從而保護(hù)固氮酶免受氧氣的破壞。由此可見，在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中直接表達(dá)固氮酶系，必需同時引入氧保護(hù)機(jī)制，否則固氮酶的生物活性必然被破壞。

于是，研究人員將目光轉(zhuǎn)向了真核生物的兩種半自主細(xì)胞器，質(zhì)體/葉綠體和線粒體。它們作為生物固氮合成生物學(xué)研究的細(xì)胞器底盤具有較好的優(yōu)越性。例如，二者均具有原核轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)，允許利用細(xì)菌啟動子表達(dá)以操縱子形式組織的固氮基因簇；局部產(chǎn)生固氮酶功能必需的ATP和還原力；母系遺傳，避免重組基因通過受精擴(kuò)散。在質(zhì)體中，可以通過高效同源重組實(shí)現(xiàn)基因組定位的特異性；在線粒體中，含有Fe-S簇裝配機(jī)器，呼吸作用導(dǎo)致基質(zhì)氧氣耗竭，為氧敏感的蛋白表達(dá)及發(fā)揮功能提供了可能［15］。因此，研究人員展開了以植物葉綠體或者酵母線粒體為底盤的固氮基因工程化研究。

早在2005年，Dixon實(shí)驗(yàn)室報道在衣藻質(zhì)體中成功表達(dá)重組NifH蛋白［16］。2016年，Ivleva等［17］報道將nifH基因整合至煙草質(zhì)體基因組，獲得了NifH蛋白。但是，到目前為止尚未見將整個nif基因簇或者最小基因簇整合入質(zhì)體基因組，并表達(dá)出完整的固氮酶的報道。

2016年，Rubio實(shí)驗(yàn)室報道在好氧生長的酵母線粒體基質(zhì)中成功地表達(dá)了固氮酶鐵蛋白NifH和成熟酶NifM，而在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)NifH，除了厭氧條件還需要共表達(dá)NifM、NifU和NifS［18］。2017年，該實(shí)驗(yàn)室成功地在酵母線粒體中表達(dá)了9個維氏固氮菌（A. vinelandii）的nif基因（nifH、D、K、U、S、M、B、E和N），其中NifDK還形成了四聚體［19］。但是這些蛋白是否在線粒體基質(zhì)中形成了有功能的固氮酶系有待進(jìn)一步研究。另外，在植物細(xì)胞中尚未建立線粒體遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。

天然固氮酶系發(fā)揮作用時，需要與電子傳遞蛋白（如電子供體蛋白）匹配，獲得打開氮氮三鍵必需的高能電子。那么植物中質(zhì)體、葉綠體或者線粒體等細(xì)胞器中是否有相應(yīng)的功能蛋白提供電子支撐固氮酶發(fā)揮作用呢？這是固氮合成生物學(xué)研究中一個重要問題。2017年，北京大學(xué)王憶平實(shí)驗(yàn)室［20］應(yīng)用合成生物學(xué)模塊化方法評估了來自于葉綠體、根質(zhì)體和線粒體中充當(dāng)Mo固氮酶和Fe固氮酶的電子供體，發(fā)現(xiàn)來自于植物葉綠體的電子轉(zhuǎn)移組份能夠用來支持約30%的固氮酶活性。該研究結(jié)果提示在植物中工程化固氮酶的目標(biāo)基因數(shù)量可以減少。

2.2 固氮酶基因簇及其調(diào)控回路簡化

固氮微生物中固氮（nif）基因簇一般由十幾到二十幾個基因形成多個操縱子，其表達(dá)受環(huán)境因子如溫度、化合態(tài)氮和氧氣濃度調(diào)節(jié)。大量的編碼基因和復(fù)雜的調(diào)控區(qū)不利于合成生物學(xué)操作。因此，研究人員一方面致力于尋找具有簡約固氮基因簇的固氮系統(tǒng)；另一方面應(yīng)用合成生物學(xué)方法對熟知的固氮基因簇進(jìn)行簡化。這兩個方面目前均取得較好的進(jìn)展。2013年，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳三鳳實(shí)驗(yàn)室報道一種固氮類芽孢桿菌P.WLY78，其固氮基因簇由9個基因組成，包括nifB、nifH、nifD、nifK、nifE、nifN、nifX、hesA和nifV。將該基因簇轉(zhuǎn)移至大腸桿菌中，合成了具有一定催化活性的固氮酶［21］。2016年，該實(shí)驗(yàn)室從P.sp.WLY78和K.oxytoca中選擇了28個基因分別置于兩個質(zhì)粒上受類芽孢桿菌nif啟動子控制，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)類芽孢桿菌suf操縱子（Fe-S簇裝配）和潛在的電子傳遞基因spfoAB，fldA和fer增加了固氮酶活性；K. oxytoca的nifSU（Fe-S簇裝配）和nifFJ（固氮酶特異的電子轉(zhuǎn)運(yùn)）也能增強(qiáng)固氮酶的活性；混合裝配類芽孢桿菌潛在的電子轉(zhuǎn)運(yùn)基因（pfoA/B，fldA）和K. oxytoca nifSU可以將固氮酶活恢復(fù)到野生菌的50.1%。這些研究結(jié)果顯示輔助鐵硫簇裝配和電子傳遞的蛋白質(zhì)對于固氮酶活性的提高至關(guān)重要［22］。

北京大學(xué)王憶平實(shí)驗(yàn)室在肺炎克氏固氮菌（K.oxytoca）固氮基因簇的簡化方面做了系列工作。2013年，該實(shí)驗(yàn)室報道應(yīng)用改造的T7啟動子可以平衡表達(dá)nif操縱子，并去除了固氮基因的天然調(diào)控回路。而且在大腸桿菌（E. coli）中，用不同強(qiáng)度的T7啟動子獲得不同表達(dá)水平的固氮酶，其活性可以達(dá)到天然固氮酶系的42%［23］。該工作簡化了固氮基因調(diào)控回路。2014年，該實(shí)驗(yàn)室在大腸桿菌中工程化一個Fe-Fe固氮酶系統(tǒng)，通過融合anf結(jié)構(gòu)基因和附屬的nif基因，形成了一個少至10個基因組成的固氮基因簇，成功表達(dá)具有活性的Fe-Fe固氮酶［24］。該工作簡化了固氮基因簇。2018年，該實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了一個病毒來源的多蛋白“融合和剪切”的技術(shù)體系，將14個固氮必需基因選擇性地裝配形成5個巨大基因，減少了基因數(shù)量，固氮酶的各組份平衡表達(dá)，具有生物活性，工程細(xì)菌能夠以氮?dú)鉃榈瓷L繁殖［25］。該研究創(chuàng)造了一個固氮基因的簡化工具，同時簡化了固氮基因的組織形式。

2.3 病原細(xì)菌共生功能的人工進(jìn)化

隨著豆科植物-根瘤菌共生互作機(jī)制研究的不斷深入，很多研究者已經(jīng)意識到共生結(jié)瘤固氮，至少包括根瘤菌原基起始和根瘤菌侵染兩個協(xié)調(diào)的過程，而后一個過程與宿主免疫控制機(jī)制關(guān)聯(lián)。因此，有研究者提出了新的固氮合成生物學(xué)思路，即以植物病原菌為底盤，通過人工進(jìn)化使其獲得結(jié)瘤和侵染能力。2010年，Marchetti等［26］報道對攜帶有根瘤菌Cupriavidus taiwanensis共生質(zhì)粒的病原菌Ralstonia solanacearum進(jìn)行人工進(jìn)化，通過失活T3SS的hrcV基因，工程菌株在Mimosa上發(fā)生早期侵染事件，并且結(jié)瘤；而失活毒性調(diào)節(jié)基因hrpG則促使工程菌株對根瘤細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)侵染。2013年，同一實(shí)驗(yàn)室對相關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證［27］。但是沒有后續(xù)固氮酶表達(dá)和活性水平的結(jié)果。該研究顯示T3SS系統(tǒng)在細(xì)菌與宿主植物共生互作時抑制宿主免疫反應(yīng)方面發(fā)揮了重要作用。一些大豆根瘤菌T3SS的結(jié)瘤功能研究和廣譜根瘤菌S.NGR234的T3SS效應(yīng)子的遺傳學(xué)研究也支持這一推測［28-29］。有趣的是，除了通過定向篩選將根瘤菌共生質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至病原細(xì)菌以外，在自然界還存著共生質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象［30］，這說明共生質(zhì)粒完全可以進(jìn)行合成生物學(xué)操作。

2.4 禾谷類作物的共生功能改造

通過對模式豆科植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和百脈根（Lotus japonicus）的遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究成功地鑒定了結(jié)瘤因子（Nod factor）的受體激酶MtNFP1/LYK3和LjNFR1/NFR5、鈣離子通道蛋白DMI1、鈣調(diào)素依賴的受體激酶DMI3以及轉(zhuǎn)錄因子 NSP1、NSP2、NIN和 ERN1等［31］。叢枝菌根共生研究顯示其與結(jié)瘤共生存在部分相同的信號傳導(dǎo)途徑，而叢枝菌根共生的植物包括禾谷類作物等絕大多數(shù)的陸生高等植物，為應(yīng)用合成生物學(xué)工具，將豆科植物結(jié)瘤共生系統(tǒng)移入非豆科植物提供了可能性［32］。目前，已有華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張忠明實(shí)驗(yàn)室報道獲得了百脈根共同結(jié)瘤信號途徑基因（LjLHK1、LjNSP1、LjNSP2和LjNIN）的轉(zhuǎn)基因水稻，并對轉(zhuǎn)錄組的變化進(jìn)行了分析［33］。

3 展望

近年來，固氮合成生物學(xué)研究取得了良好的進(jìn)展，如北京大學(xué)王憶平實(shí)驗(yàn)室在固氮酶基因簇的簡化方面，Rubio實(shí)驗(yàn)室以酵母線粒體為底盤的固氮酶基因的表達(dá)方面均取得出色的研究成果。但是固氮合成生物學(xué)的發(fā)展也面臨不少困難和障礙。

首先是固氮酶的氧敏感性和固氮酶系合成控制的復(fù)雜性問題。自然固氮系統(tǒng)進(jìn)化出了多種氧保護(hù)機(jī)制，固氮合成生物學(xué)如何建立氧保護(hù)系統(tǒng)。例如，將簡化的固氮酶基因簇導(dǎo)入葉綠體基因組，表達(dá)的固氮酶，如何避免氧破壞？建立隔離空間還是時序控制，這些均涉及到葉綠體發(fā)育機(jī)制，屬于葉綠體基礎(chǔ)生物學(xué)范疇。研究者認(rèn)為線粒體基質(zhì)具有低氧屬性，有利于固氮酶的氧保護(hù)作用，但是并未見到固氮酶活性的報道，而且我們對植物線粒體的理解還是非常有限，遺傳操作技術(shù)幾乎是空白。

另外，固氮酶基因的表達(dá)調(diào)控是固氮細(xì)菌物質(zhì)、能量代謝和信號感受控制網(wǎng)絡(luò)中一個子系統(tǒng)，該網(wǎng)絡(luò)實(shí)時感受環(huán)境信號變化（化合態(tài)氮、氧氣、溫度、pH、滲透壓和生物鐘）調(diào)節(jié)固氮酶基因表達(dá)，最大限度的減少能量和物質(zhì)浪費(fèi)，達(dá)到自然經(jīng)濟(jì)目標(biāo)。固氮反應(yīng)畢竟是一個高耗能過程，能量的輸入與氮素的輸出，受細(xì)胞器和細(xì)胞的穩(wěn)定性與宿主生長發(fā)育需求塑造。合成生物學(xué)如何能使固氮酶基因的表達(dá)適應(yīng)細(xì)胞器、細(xì)胞和宿主的生理狀態(tài)變化，這些都是必須考慮的基本理論問題。

其次，在豆科植物-根瘤菌共生固氮體系中，盡管我們對結(jié)瘤因子的信號傳導(dǎo)已經(jīng)有了相當(dāng)?shù)恼J(rèn)識，如受體激酶、鈣離子通道和鈣調(diào)素結(jié)合蛋白以及和各種轉(zhuǎn)錄因子等，但是該結(jié)瘤因子信號傳導(dǎo)途徑也只是共生固氮信號網(wǎng)絡(luò)的一個子系統(tǒng)。合成生物學(xué)試圖利用已經(jīng)存在的共同結(jié)瘤信號途徑，在禾谷類作物中重建這一系統(tǒng)，最大的問題是如何與內(nèi)源的信號系統(tǒng)耦合，如內(nèi)源植物激素、免疫信號系統(tǒng)的耦合，即使大量豆科植物特有的共生基因成功轉(zhuǎn)移至禾谷類，且成功表達(dá)，能否形成早期的發(fā)育與侵染事件還有待進(jìn)一步摸索。重要的是，人們并不清楚（1）根瘤菌在侵染過程中，宿主植物免疫反應(yīng)的作用機(jī)制以及根瘤菌適應(yīng)宿主免疫反應(yīng)，控制自身分裂增殖的分子機(jī)制；（2）根瘤菌通過胞吞釋放到根瘤植物細(xì)胞時的分裂控制機(jī)制；豆血紅蛋白時空特異性表達(dá)，創(chuàng)造微氧環(huán)境的調(diào)節(jié)機(jī)制以及根瘤中分化的類菌體適應(yīng)微氧環(huán)境的機(jī)制；（3）豆科植物種子灌漿時促進(jìn)固氮根瘤衰老的生化機(jī)制等。這些基本理論問題都是發(fā)展固氮合成生物學(xué)所要考慮的。

最后，固氮合成生物學(xué)研究尚處于起始階段，我國要想在這一領(lǐng)域引領(lǐng)世界，必須要有一個長遠(yuǎn)的規(guī)劃，如建立多模塊研究系統(tǒng)（如結(jié)瘤起始模塊、侵染與免疫抑制模塊、胞內(nèi)信號感受與細(xì)胞分裂增殖控制模塊和固氮與氮轉(zhuǎn)運(yùn)模塊等），全國各研究單位分工協(xié)作，才有可能最終實(shí)現(xiàn)固氮細(xì)胞器人工合成的目標(biāo)。