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(河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475000)

生物傳感器誕生于上世紀(jì)六十年代，經(jīng)過(guò)50多年的不斷改進(jìn)和發(fā)展，各種新型材料、技術(shù)手段逐漸被引入生物傳感器的研究，給生物傳感器領(lǐng)域增添了新的生機(jī)與活力。在生物傳感器中，酶生物傳感器的出現(xiàn)打破了傳統(tǒng)的做法和思維，成為生物傳感領(lǐng)域的一大熱門研究方向。研究者嘗試將各種新型材料引入生物傳感領(lǐng)域，尤其是納米材料的發(fā)展，將生物傳感器的研究帶入了一個(gè)新階段。生物傳感器中最常用的是酶電極，酶電極制備的關(guān)鍵就是如何在保持酶活性的同時(shí)將酶固定在電極上。然后用各種方法對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究。

1 不同材料在辣根過(guò)氧化物酶?jìng)鞲衅髦械膽?yīng)用研究

許淑霞,吳金生等[1]針對(duì)用純物理方法固定酶易使其脫落的問(wèn)題，為解決這一問(wèn)題，他們將納米金與HRP混合物再固定在多壁碳納米管(MWNTs)修飾的Pt電極上，且碳納米管、納米金對(duì)電流有放大作用，大大提高了傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性，具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

祝敬妥，張卉等[2]將殼聚糖和無(wú)摻雜的金剛石納米粒子(UND)電沉積到玻碳電極表面，再進(jìn)一步固定上HRP。又用SEM表征、電化學(xué)交流阻抗、循環(huán)伏安等技術(shù)來(lái)研究復(fù)合膜及HRP生物活性。即此復(fù)合膜實(shí)現(xiàn)了HRP和電極之間的直接電子傳遞，可用于研制更靈敏的過(guò)氧化氫傳感器。

馮亞娟，魏玉萍等[3]經(jīng)Hummer法等自主合成了氧化石墨烯(GO)，并將其與納米金顆粒、殼聚糖(CHIT)及HRP混合修飾到玻碳電極上，制得H2O2傳感器。通過(guò)檢測(cè)pH值、工作電位的影響優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，很好地增長(zhǎng)了傳感器的使用壽命。

接德麗 ，徐歡等[4]利用既環(huán)保又有良好的生物相容性肌醇六磷酸鈣(Ca-IP6)與HRP共同制得Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE傳感器。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該電極對(duì)過(guò)氧化氫，響應(yīng)迅速、穩(wěn)定性好。

姚慧，李小紅等[5]用室溫離子液體作粘合劑，在石墨中加入一定量的碳納米管制成新型碳糊電極后，用于H2O2的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，這種新型碳糊電極對(duì)過(guò)氧化氫響應(yīng)迅速，電催化活性高，更有利于電子的有效傳遞，同時(shí)良好的穩(wěn)定性和選擇性使其在實(shí)時(shí)檢測(cè)中具有更廣闊的應(yīng)用前景。

2 各種電化學(xué)方法用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析討論

電化學(xué)分析根據(jù)測(cè)量方法能分為許多種，其中循環(huán)伏安法(CV)是最為常用的一種研究方法，其可對(duì)電極上的電活性物進(jìn)行定性、定量分析，以得到電極反應(yīng)過(guò)程的電子轉(zhuǎn)移數(shù)、電子傳遞速率、熱力學(xué)可逆性和各種動(dòng)力學(xué)參數(shù)等，從而能進(jìn)一步了解電極反應(yīng)的機(jī)制機(jī)理。

2.1 表征

潘羽俠等[7]利用微波合成法合成植酸鈦納米材料，并與辣根過(guò)氧化物酶共修飾到玻碳電極表面，又用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)分別表征了植酸鈦與HRP混合前后的形貌變化，來(lái)說(shuō)明HRP已經(jīng)很好地修飾到植酸鈦上，這種結(jié)構(gòu)也有助于實(shí)現(xiàn)直接電子傳遞。

焦守峰等[8]合成了金納米粒子修飾的PDA球，對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的表征，SEM圖上可觀察到PDA納米球上均勻地修飾上了AuNPs，更進(jìn)一步確定了其形貌和組成。

2.2 修飾電極的直接電化學(xué)行為

陳緒胄，李建平[9]用不同電極在磷酸鹽緩沖溶液中于0.1～-0.6V間進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，結(jié)果顯示，HRP/Ag/Cys/GCE 電極有一對(duì)氧化還原峰，并且 HRP在Ag/Cys/GCE電極表面能進(jìn)行穩(wěn)定、有效的直接電子轉(zhuǎn)移。根據(jù) HRP/Ag/Cys/GCE電極在 0.067 mol/L PBS(pH值7.0)中不同掃描速度下的循環(huán)伏安曲線，可做出氧化還原峰值電流大小與掃速的平方根呈線性關(guān)系，來(lái)表明該電極表面擴(kuò)散的機(jī)制。

焦守峰等[8]研究了不同電極的電化學(xué)行為，發(fā)現(xiàn)AuNPs對(duì)HRP 的直接電化學(xué)過(guò)程至關(guān)重要。Nafion/HRP-Au/PDA/GC 電極的CV 圖上分別在-347 mV 和-378 mV 給出了HRP的氧化峰和還原峰，對(duì)應(yīng)于HRP-Fe(III)/HRP-Fe(II) 電對(duì)的單電子氧化-還原過(guò)程。由于PDA表面對(duì)蛋白質(zhì)的強(qiáng)吸附作用，HRP 的式量電位更接近其氧化還原標(biāo)準(zhǔn)式量電位。且隨著H2O2的加入，HRP 的氧化峰電流逐漸減小，還原峰電流線性增加?；诖耍刹捎糜?jì)時(shí)電流法，有望在0.10～0.30 μmol/L范圍內(nèi)用于實(shí)際樣品中生物反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2的檢測(cè)。

2.3 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.3.1 修飾電極對(duì)H2O2的催化響應(yīng)

姚慧等[5]用制成的新型碳糊酶電極(HRP/MWCNTs/CILE)，在適合的磷酸緩沖溶液中對(duì)H2O2檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)還原峰和氧化峰強(qiáng)度均增大，這說(shuō)明HRP對(duì)于H2O2的還原有明顯的催化作用。

高海燕等[11]用聚氨酯丙烯酸酯預(yù)聚體和辣根過(guò)氧化物酶混合修飾在玻碳電極表面，通過(guò)光固定法制備得到HRP-PUA/GC電極。檢測(cè)HRP-PUA/GC電極對(duì)H2O2的催化活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，氧化峰和還原峰峰值電流均有明顯的變化。

2.3.2 pH值的影響

王超凡等[12]用乙二胺將酪氨酸酶(Tyr)固定在功能化GO修飾的玻碳電極(GCE)上。然后用不同pH值檢測(cè)對(duì)HQ影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，pH值6.5時(shí)氧化峰值電流達(dá)到最大；這與該酶pH值的相近，酶的活性未被改變，因此選擇pH值6.5作為該體系測(cè)試的pH值。

趙紅葉等[13]基于SiO2和Fe3O4納米粒子構(gòu)置出Hb-Fe3O4-SiO2-Chit/ITO電極，研究了血紅蛋白在該電極上的電子傳遞的機(jī)制，并考察了溶液pH值對(duì)Hb-Fe3O4-SiO2-Chit/ITO中Hb的循環(huán)伏安行為的影響，發(fā)現(xiàn)E0'與pH值的斜率為-48.3 mV·pH值-1，這與一電子一質(zhì)子反應(yīng)的理論值(-59.0mV·pH值-1)接近。當(dāng)溶液pH值=7.0時(shí)，Hb的響應(yīng)最大，因此實(shí)驗(yàn)選擇pH值7.0的PBS作支持電解質(zhì)。

2.3.3 工作電位的影響

馮亞娟，魏玉萍等[3]將合成的氧化石墨烯與納米金顆粒、殼聚糖、辣根過(guò)氧化酶混合修飾到玻碳電極上，然后進(jìn)行條件優(yōu)化，在測(cè)試工作電位時(shí)，發(fā)現(xiàn)在-0.10 V作為工作電位時(shí)可以避免一些干擾物在負(fù)電位下的還原。

黃銳[14]在新型碳納米材料的酶及生物堿電化學(xué)傳感技術(shù)研究中，用全修飾的新電極，在優(yōu)化檢測(cè)電位時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)工作電位從-0.4V上升到-0.25V，響應(yīng)電流逐漸增大；-0.25V上升到-0.1V時(shí)，還原電流又呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)。在過(guò)負(fù)的電位下，一些物質(zhì)容易發(fā)生還原反應(yīng)而產(chǎn)生干擾。故實(shí)驗(yàn)選擇-0.25V作為檢測(cè)電位。

2.4 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

高海燕等[11]將HRP-PUA/GC電極在合適的PBS中連續(xù)循環(huán)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除最開始的1圈峰形有異常外，之后的峰電流仍然幾乎不變，表明HRP在電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移隨連續(xù)掃描次數(shù)的增加是相當(dāng)穩(wěn)定的。然后又將全修飾電極保存在相應(yīng)的PBS中一個(gè)月，其伏安響應(yīng)幾乎無(wú)明顯變化，進(jìn)一步表明該電極有極高的穩(wěn)定性。

郭小玉，苗云等[15]將修飾好的Nafion/HRP-IP6 micelles-GNPs/GCE電極進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試。先在PBS中以100 mV/s 連續(xù)掃描50圈，其響應(yīng)電流無(wú)變化。Nafion/HRP-IP6 micelles-GNPs/GCE 傳感器放置在4℃下儲(chǔ)存30d后，測(cè)定其循環(huán)伏安電流及峰位置是否發(fā)生變化，且得到的響應(yīng)電流為初始電流的94%。因此，全修飾電極有很好的穩(wěn)定性。

2.5 抗干擾性測(cè)試

王超凡等[12]用乙二胺將Tyr共價(jià)修飾到功能化GO上。然后對(duì)該電極進(jìn)行一些干擾物質(zhì)的檢測(cè)，其誤差控制在±5%以內(nèi)，對(duì)0.2 mmol/L HQ溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，大多離子和酚類的有機(jī)物對(duì)HQ的測(cè)定不會(huì)造成干擾。

馬麗萍等[16]將HRP直接固定在電聚合ZrO2修飾的金電極表面制得了新型HRP酶生物傳感器。在含有0.15 mmol/L H2O2的PBS中，分別加入0.30 mmol/L的5種干擾物質(zhì)，測(cè)定它們對(duì)該傳感器響應(yīng)信號(hào)的干擾情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些物質(zhì)基本不會(huì)影響H2O2的測(cè)定。

3 展望

隨著各種新型材料的問(wèn)世，酶的直接電化學(xué)已進(jìn)入到一個(gè)新的發(fā)展階段。越來(lái)越多的科研工作者嘗試使用納米金、富勒烯、納米二氧化鈦、離子液體等多種材料與酶結(jié)合，構(gòu)建出許多新型的生物傳感器，大大拓寬了其應(yīng)用范圍，在科學(xué)研究、疾病診斷、食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有重要作用。本文著重總結(jié)了近年來(lái)酶生物傳感器領(lǐng)域的一些研究成果，并列舉出一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的電化學(xué)分析方法，希望對(duì)生物傳感器的研究原理和過(guò)程有更清晰的認(rèn)識(shí)，更期望通過(guò)學(xué)習(xí)前人的大量實(shí)驗(yàn)成果，尋找到生物傳感器領(lǐng)域的新突破。

致謝: 感謝河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院對(duì)本項(xiàng)目以及參加全國(guó)大學(xué)生生命科學(xué)聯(lián)賽的大力支持。