黃 喆, 周 靜, 潘素君, 劉 敬, 戴良英, 李 魏*

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 長(zhǎng)沙 410128;2.婁底職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)林工程學(xué)院, 湖南 婁底 417000

植物借助先天免疫反應(yīng)和受侵染部位產(chǎn)生的系統(tǒng)信號(hào)抵御病原微生物的入侵。植物先天免疫系統(tǒng)可分為兩大類，一類是由病原物相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng) (PAMP-triggered immunity，PTI)，它構(gòu)成植物體內(nèi)免疫反應(yīng)的第一道防線。另一類是由病原菌效應(yīng)因子(effector) 激發(fā)的免疫反應(yīng) (effector-triggered immunity，ETI)，為植物免疫反應(yīng)的第二道防線。在ETI反應(yīng)中，效應(yīng)因子是病原菌為了能夠成功侵染植物，克服寄主細(xì)胞自身免疫系統(tǒng)的識(shí)別而產(chǎn)生。然而效應(yīng)因子扮演著雙重角色，既是抗性抑制因子又是抗性誘導(dǎo)因子[1]。丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringae)屬革蘭氏陰性菌，是為害十分廣泛的植物病原細(xì)菌，它可以感染植物的地上部分，使植物出現(xiàn)葉斑病、葉片壞死、潰瘍病等疾病[2]。根據(jù)該菌侵染寄主植物方式的不同以及所致病害的不同特征，可將丁香假單胞桿菌大約分為64個(gè)致病變種，每個(gè)致病變種中都有多個(gè)效應(yīng)因子[3]。隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，效應(yīng)因子已成為當(dāng)前生物學(xué)研究的熱門(mén)領(lǐng)域之一。本文主要介紹了丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子在植物體內(nèi)致病和誘導(dǎo)抗性的分子機(jī)制，以期對(duì)植物抗病機(jī)理研究、植物病害防治以及農(nóng)作物抗性基因與種質(zhì)資源挖掘、抗病遺傳育種等領(lǐng)域提供參考信息和策略。

1 效應(yīng)因子的分類

最初，人們把病原菌效應(yīng)因子理解為一類能夠改變寄主結(jié)構(gòu)與功能的蛋白[4]。因此，效應(yīng)因子又被稱為效應(yīng)蛋白[5]。效應(yīng)因子根據(jù)其介導(dǎo)的病原物-寄主植物親和或者不親和互作可分為毒性(Vir)效應(yīng)因子和無(wú)毒(Avr)效應(yīng)因子。

1.1 丁香假單胞桿菌TTSS系統(tǒng)

病原菌一旦進(jìn)入寄主細(xì)胞間隙，則主要通過(guò)分泌系統(tǒng)向宿主細(xì)胞內(nèi)傳遞效應(yīng)因子[6,7]。植物病原細(xì)菌在寄主植物體內(nèi)的生存方式有賴于其自身分泌的效應(yīng)因子。目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌效應(yīng)因子的分泌系統(tǒng)共有6類(I～VI)[8,9]。細(xì)菌通過(guò)寄主植物的自然孔口(例如氣孔)或傷口進(jìn)入植物并在細(xì)胞間隙中增殖，其中一個(gè)主要的發(fā)病機(jī)制是由III型分泌系統(tǒng)(type three secretion system, TTSS)所介導(dǎo)的[10～12]。研究發(fā)現(xiàn)植物病原菌的TTSS具有向寄主細(xì)胞注射致病性因子、輸出Harpins、運(yùn)輸效應(yīng)蛋白的功能[13,14]。因此，TTSS是丁香假單胞桿菌侵染過(guò)程中重要的蛋白分泌系統(tǒng)，其由hrp基因編碼[15]。Jin等[16]和Li等[17]研究表明，丁香假單胞桿菌的TTSS系統(tǒng)具有較長(zhǎng)的菌毛，該菌毛能夠引導(dǎo)效應(yīng)蛋白通過(guò)植物細(xì)胞壁和植物細(xì)胞膜或者通過(guò)植物質(zhì)膜。通過(guò)該系統(tǒng)，病原菌效應(yīng)蛋白被直接注入宿主細(xì)胞中，對(duì)寄主的防御機(jī)制起到抑制作用，從而使病原菌在寄主體內(nèi)得以進(jìn)一步繁殖和侵染[18,19]。許多丁香假單胞桿菌的III型效應(yīng)因子(type III effectors, T3Es)是調(diào)控植物與病原微生物相互作用的關(guān)鍵性因子[20]。這些T3Es中很多具有不同酶活性，包括半胱氨酸蛋白酶(如AvrPphB和AvrRpt2)、單-ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(HopU1和HopF2)、磷酸蘇氨酸裂解酶(HopAI1)、E3泛素連接酶(AvrPtoB)和蛋白酪氨酸磷酸酶(HopAO1)等[21,22]，利用這些酶調(diào)控寄主植物體內(nèi)的一系列抗病與感病反應(yīng)。雖然TTSS的注射和運(yùn)輸機(jī)制仍在探究和摸索之中，但人們已經(jīng)普遍接受它是植物病原細(xì)菌致病和誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)過(guò)程中所必須的蛋白分泌系統(tǒng)。

1.2 丁香假單胞桿菌毒性效應(yīng)因子

毒性效應(yīng)因子，如丁香假單胞桿菌的VirPphA、 HopAI1、 HopM1、HopU1、HopF2等，能以不同的方式破壞植物的免疫系統(tǒng)，它們介導(dǎo)丁香假單胞桿菌與寄主植物間的親和作用[21,23～25]。VirPphA是P.syringaepv.phaseolicola中最早鑒定出具有毒性功能的效應(yīng)因子[23]，它可以抑制其他效應(yīng)因子激發(fā)宿主產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，促進(jìn)病原微生物加速對(duì)宿主的侵染。RIN4是HopF2的主要毒力靶標(biāo)，HopF2可以通過(guò)靶向擬南芥RIN4蛋白以促進(jìn)丁香假單胞桿菌的毒力，另外HopF2也可以在擬南芥體內(nèi)與寄主AtMKK5蛋白互作，從而抑制寄主的PTI反應(yīng)[24,26]。2014年，Block等[27]研究表明丁香假單胞桿菌番茄變種 DC3000的毒性效應(yīng)因子HopD1通過(guò)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與宿主膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子NTL9相互作用來(lái)抑制植物的ETI反應(yīng)。另外，丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子HopAF1、HopB1和HopG1等毒性效應(yīng)因子可通過(guò)阻斷乙烯誘導(dǎo)、特異性地破壞免疫受體BAK1以及促進(jìn)宿主轉(zhuǎn)錄抑制因子降解等方式抑制植物的天然免疫系統(tǒng)[28～31]。總之，近年的研究表明丁香假單胞桿菌可以進(jìn)化出不同的毒性效應(yīng)因子，以不同的方式干擾或破壞植物的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而侵染宿主細(xì)胞。

1.3 丁香假單胞桿菌無(wú)毒效應(yīng)因子

病原物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)因子能夠抑制寄主植物的PTI反應(yīng)，為克服毒性效應(yīng)因子的這種抑制作用，植物隨之進(jìn)化出相應(yīng)的R蛋白感知病原物分泌的效應(yīng)因子，激活過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response, HR)，即ETI。此時(shí)的效應(yīng)因子被稱之為無(wú)毒(Avr)效應(yīng)因子。病原物Avr基因與植物R基因之間的特異性識(shí)別與互作是植物實(shí)現(xiàn)抗病性的關(guān)鍵。第一個(gè)克隆到的Avr基因是來(lái)源于丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)的avrA基因[32,33]。另外，丁香假單胞桿菌中的Avr基因，如AvrPphB、AvrPto、AvrPtoB、AvrRpm1、AvrRpt2等介導(dǎo)丁香假單胞桿菌與寄主植物間的不親和作用也被人們深入研究。病原物Avr基因進(jìn)入寄主細(xì)胞后，往往會(huì)對(duì)寄主細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行修飾或化學(xué)催化，而這種修飾或者化學(xué)催化作用會(huì)被寄主體內(nèi)的R蛋白識(shí)別進(jìn)而引起HR。如丁香假單胞桿菌的Avr效應(yīng)因子AvrRpt2能夠剪切植物蛋白R(shí)IN4，從而激活寄主植物體內(nèi)的R蛋白R(shí)PS2，進(jìn)而啟動(dòng)基因?qū)虻目剐訹34～36]。而丁香假單胞桿菌的AvrB和AvrRpm1則磷酸化RIN4，被磷酸化修飾的RIN4被寄主植物體內(nèi)的R蛋白R(shí)PM1感應(yīng)后即激發(fā)HR反應(yīng)[37]。

有意思的是，病原微生物的毒性效應(yīng)因子與無(wú)毒效應(yīng)因子介導(dǎo)親和作用還是不親和作用并不是絕對(duì)的，而是由寄主體內(nèi)有無(wú)相應(yīng)的R基因決定的。當(dāng)無(wú)毒效應(yīng)因子對(duì)應(yīng)的寄主體內(nèi)的R基因缺失或者喪失功能時(shí)，無(wú)毒效應(yīng)因子就會(huì)變?yōu)槎拘孕?yīng)因子，介導(dǎo)親和作用[38]。如丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子AvrRptoB能與番茄抗性基因Pto互作引發(fā)HR反應(yīng)，但在缺失Pto的植物中，AvrRptoB便會(huì)抑制寄主植物的程序性壞死反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)[39,40]。再如丁香假單胞桿菌III型效應(yīng)因子AvrRpm1和AvrRpt2在沒(méi)有抗性蛋白R(shí)PM1和RPS2的情況下通過(guò)靶向F-box蛋白COI1依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)促進(jìn)細(xì)菌毒力[41]。

2 丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子與寄主植物R基因的互作方式

目前，關(guān)于丁香假單胞桿菌Avr效應(yīng)因子和寄主植物體內(nèi)的R基因的識(shí)別方式主要有2種假說(shuō)，一是直接識(shí)別模式，另一種是間接識(shí)別模式。

2.1 直接識(shí)別模式

直接識(shí)別模式又稱受體-配體模型。早期，Harold Flor從遺傳學(xué)角度提出了“基因?qū)颉奔僬f(shuō)，并且表征了數(shù)十種R-Avr基因組合[1,42]。該假說(shuō)簡(jiǎn)而言之就是寄主植物通過(guò)其體內(nèi)的R基因產(chǎn)物直接識(shí)別對(duì)應(yīng)的病原微生物的無(wú)毒效應(yīng)因子，進(jìn)而產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗病反應(yīng)即HR。例如，丁香假單胞桿菌分泌的無(wú)毒效應(yīng)蛋白AvrPto與寄主植物的R蛋白Pto產(chǎn)生直接物理互作進(jìn)而激發(fā)Pto介導(dǎo)的HR[43]。然而，就現(xiàn)有的研究結(jié)果來(lái)看，人們對(duì)于之前被認(rèn)為是直接識(shí)別關(guān)系的R-Avr組合又有了新的見(jiàn)解，并且對(duì)于許多R-Avr組合，其物理上的相互作用尚未被觀察到，所以這種R-Avr直接識(shí)別的方式并不多見(jiàn)。

2.2 間接識(shí)別模式

近年來(lái)，有大量報(bào)道指出植物許多R蛋白與病原物Avr蛋白之間并不發(fā)生直接的物理互作，而是通過(guò)一種間接的方式進(jìn)行識(shí)別。目前，間接識(shí)別模式最常見(jiàn)的有警戒模式 (guard model) 和誘餌模式 (decoy model)兩種。

2.2.1警戒模式 警戒模式即病原物效應(yīng)因子與寄主植物體內(nèi)的靶標(biāo)蛋白(中間蛋白)識(shí)別后，對(duì)該靶標(biāo)進(jìn)行剪切或修飾，R蛋白在監(jiān)測(cè)到中間蛋白的剪切或修飾后被激活，從而觸發(fā)寄主的ETI。這種情況下，中間蛋白起到病原物入侵警戒的作用，因此該互作方式被稱為警戒模式[1,44]。警戒模型最初是為了解釋番茄R蛋白Pto和Prf對(duì)丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子AvrPto的感知機(jī)制[1]。目前有大量研究結(jié)果證實(shí)了警戒模式，如擬南芥體內(nèi)的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶PBS1之前一直被認(rèn)為是R基因，后來(lái)有研究證明丁香假單胞桿菌的效應(yīng)因子AvrPphB本質(zhì)是半胱氨酸蛋白酶，它首先通過(guò)對(duì)自己進(jìn)行剪切激活，再剪切寄主體內(nèi)的PBS1，寄主體內(nèi)的R蛋白R(shí)PS5在監(jiān)測(cè)到PBS1被剪切后隨即被激活，從而誘導(dǎo)了ETI，出現(xiàn)HR反應(yīng)[45]。再如上文所提及的效應(yīng)因子AvrRpt2、AvrRpm1及AvrB磷酸化修飾或剪切它們共同的靶標(biāo)RIN4后，被修飾過(guò)的RIN4至少能夠被RPS2和RPM1這兩種NBS-LRR蛋白監(jiān)控識(shí)別，進(jìn)而引起HR抗病反應(yīng)[35]。

警戒模式在一定程度上解釋了一個(gè)R蛋白如何識(shí)別多個(gè)效應(yīng)因子，這樣的話，植物就能利用相對(duì)較小范圍的R基因庫(kù)抵御廣泛多樣的病原體[1,46]。但是2005年Chisholm等[47]在其研究報(bào)告中指出，效應(yīng)因子AvrRpt2的靶蛋白并不是專一的，該效應(yīng)因子不僅能夠裂解RIN4，還能裂解其他可能的靶蛋白。但警戒模式并不能解釋這一現(xiàn)象，因此，該模式的理論缺陷也在此。

2.2.2誘餌模式 2008年Van和Kamoun[48]基于警戒模式提出了誘餌模式。誘餌是指寄主植物中一種在序列或結(jié)構(gòu)上類似于真正靶蛋白的抗病蛋白?？梢岳斫鉃榧闹髦参餅榱说挚共≡锶肭?，進(jìn)化出與病原物效應(yīng)因子真正靶蛋白的結(jié)構(gòu)與序列相似的假靶標(biāo)，該假靶標(biāo)一旦被效應(yīng)因子錯(cuò)誤識(shí)別后，就會(huì)激活R基因介導(dǎo)的HR。值得注意的是，在任何情況下，誘餌模式都意味著R蛋白識(shí)別的效應(yīng)物靶標(biāo)是誘餌(假靶標(biāo))，但該模式并不適用于病原物效應(yīng)因子缺乏對(duì)應(yīng)的R蛋白這一情況[48]。如丁香假單胞桿菌的效應(yīng)因子AvrPphB可以通過(guò)剪切擬南芥體內(nèi)的類受體激酶BIK1及其同源蛋白PBLs以發(fā)揮其致病作用，植物為此進(jìn)化出與BIK1和PBLs同源的PBS1蛋白，當(dāng)效應(yīng)因子AvrPphB錯(cuò)誤識(shí)別PBS1并切割該蛋白后，立即激活植物體內(nèi)由RPS5介導(dǎo)的HR反應(yīng)[49]。又如AvrPto的真正靶標(biāo)是FLS2和EFR1，植物為避免真正靶標(biāo)被AvrPto識(shí)別，進(jìn)化出一種類似蛋白激酶，即誘餌蛋白Pto，該蛋白作為中間蛋白競(jìng)爭(zhēng)性的與效應(yīng)因子結(jié)合，從而引發(fā)Prf介導(dǎo)的HR反應(yīng)[50]。誘餌模式仍有待進(jìn)一步研究證明，目前尚無(wú)具體研究證據(jù)對(duì)警戒模式和誘餌模式進(jìn)行確切的劃分。因?yàn)檫@兩個(gè)模式不一定是相互排斥的，當(dāng)警戒模式演變成誘餌模式時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)中間階段。因此，警戒模式的許多預(yù)測(cè)也適用于誘餌模式。

3 展望

總體而言，研究效應(yīng)因子是了解植物抗病分子機(jī)制的先決條件，也是植物病理學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。植物的抗病性和病原物的致病性并不是恒定不變的，在自然選擇的作用下, 病原物為提高它的致病性會(huì)不斷產(chǎn)生新的致病效應(yīng)因子用于攻克植物免疫系統(tǒng)，反過(guò)來(lái)，植物面對(duì)病原物的侵染也會(huì)不斷進(jìn)化出新的抗病基因以增強(qiáng)它的抗病性來(lái)抵御病原物[51]。因此，病原物效應(yīng)因子與寄主之間的互作是不斷進(jìn)化發(fā)展的。目前，雖然人們對(duì)這方面的研究日益深入，但仍有許多不清楚的地方，如R基因識(shí)別病原微生物效應(yīng)因子之后是如何激活下游免疫應(yīng)答的？人們能否設(shè)計(jì)出廣譜識(shí)別Avr基因的R基因？這些問(wèn)題都有待進(jìn)一步探究和解釋。

作為模式菌種，深入了解丁香假單胞桿菌效應(yīng)因子與寄主的互作分子機(jī)制、植物的抗病機(jī)制以及病原物的致病機(jī)制，將對(duì)植物抗病機(jī)理研究、植物病害防治等領(lǐng)域做出巨大貢獻(xiàn)，同時(shí)也有利于挖掘新的抗性基因與抗性種質(zhì)資源并利用遺傳手段培育優(yōu)良的抗病植物品種。