張小方 趙 影 李 琦

(河南省駐馬店黃淮學(xué)院，駐馬店 463000)

肺癌給人類健康造成了嚴(yán)重的威脅，根據(jù)組織學(xué)特性可分為兩種亞型：小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC是肺癌的主要亞型，占肺癌病例的85%～90%[1]。目前NSCLC的治療主要包括手術(shù)切除、化學(xué)治療、放療及免疫治療[1-3]。對(duì)不同時(shí)期的NSCLC需要不同的治療策略[4]。早期NSCLC主要采用手術(shù)切除進(jìn)行治療(68%)，其中16%的患者手術(shù)的同時(shí)需要輔助化療或放療，約18%和15%的NSCLC晚期患者分別采用化療和放療，有33%的NSCLC晚期患者需要進(jìn)行放化療[5]?；瘜W(xué)療法在NSCLC的治療過程中占據(jù)著重要的位置。中草藥由于其副作用小而被廣泛運(yùn)用于化學(xué)治療。紫草素是紫草的主要活性成分，結(jié)構(gòu)式見圖1A，屬于萘醌類物質(zhì)。紫草素具有抗炎、抗癌、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、心臟保護(hù)、抗菌及傷口愈合等作用，已在多種疾病中報(bào)道，例如關(guān)節(jié)炎、哮喘、狼瘡性腎炎、急性肺損傷、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌、結(jié)腸癌、肝癌等[6]。本文主要探索紫草素對(duì)NSCLC細(xì)胞A549運(yùn)動(dòng)能力的影響及其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系及主要試劑 肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCC號(hào)：CCL-185)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。紫草素購自Sigma公司，溶解于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)。培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)公司。Transwell小室及人工基底膜購自美國BD公司。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶14(Matrix metalloprotein 14,MMP-14)、纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)、波形蛋白Vimentin、PI3K、p-AKT和p53抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活力檢測 A549細(xì)胞于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖到約80%時(shí)傳代繼續(xù)培養(yǎng)。首先用培養(yǎng)液將紫草素稀釋到0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、400 mmol/L，再用上述含不同濃度紫草素的培養(yǎng)液將細(xì)胞制成5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。然后向96孔板中接種100 μl上述細(xì)胞懸液，對(duì)照孔用添加DMSO的培養(yǎng)液制成的細(xì)胞懸液，每個(gè)濃度接種5個(gè)孔。培養(yǎng)24 h向各孔加入10 μl的CCK-8溶液，并在37℃培養(yǎng)1～4 h，檢測450 nm處吸光值計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.2Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力 用添加了DMSO或不同濃度的紫草素的1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將A549細(xì)胞制成細(xì)胞密度為1×106cells/ml的細(xì)胞懸液，首先在Transwell下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，然后將上述細(xì)胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，37℃培養(yǎng)24 h。最后用0.5%的結(jié)晶紫對(duì)上室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，并用棉簽將上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞除去。顯微鏡下觀察細(xì)胞并統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野下的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 首先將A549細(xì)胞接種于6孔板中，過夜培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞。在單層細(xì)胞上用10 μl的槍頭劃橫線，PBS洗3次，洗去因劃痕而脫落的細(xì)胞后加入添加了DMSO或不同濃度的紫草素的完全培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)。在0 h和24 h時(shí)顯微鏡下拍照測量劃痕寬度計(jì)算劃痕愈合率。

1.2.4蛋白印跡 收集各組A549細(xì)胞用PBS清洗3次，再用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解提取總蛋白。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%的BSA進(jìn)行封閉后依次孵育相應(yīng)的一抗和二抗。最后進(jìn)行顯色并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1紫草素對(duì)NSCLC細(xì)胞A549細(xì)胞活力的影響 通過CCK-8分析不同濃度(0.5～400 mmol/L)的紫草素對(duì)NSCLC細(xì)胞A549細(xì)胞活力的影響。如圖1B所示，用低濃度的(0～10 mmol/L)的紫草素處理A549后，細(xì)胞活力仍然可以保持90%以上。高濃度的(100～400 mmol/L)的紫草素會(huì)導(dǎo)致A549細(xì)胞活力下降，且A549細(xì)胞活力會(huì)隨著紫草素濃度的升高而降低。上述結(jié)果表明，紫草素可減弱NSCLC細(xì)胞A549細(xì)胞活力，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用20、50、100 mmol/L作為低中高三組處理組。

2.2紫草素對(duì)NSCLC細(xì)胞A549侵襲能力的影響 利用Transwell檢測NSCLC細(xì)胞A549侵襲能力。圖2A顯示，紫草素處理A549后，穿過Transwell小室基底膜的細(xì)胞數(shù)目明顯變少。由圖2B可知，紫草素(20、50、100 mmol/L)組每個(gè)視野下的侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯少于對(duì)照組(P<0.05)。由此可見，紫草素可減弱NSCLC細(xì)胞A549細(xì)胞侵襲能力。

2.3紫草素對(duì)NSCLC細(xì)胞A549遷移能力的影響 通過劃痕試驗(yàn)分析紫草素對(duì)NSCLC細(xì)胞A549細(xì)胞遷移能力的影響。如圖3A所示，劃線24 h后，紫草素組劃痕間距明顯大于對(duì)照組。由圖3B可知，與對(duì)照組相比，紫草素(20、50、100 mmol/L)組劃痕愈合率明顯降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明，紫草素可減弱NSCLC細(xì)胞A549細(xì)胞遷移能力。

2.4紫草素對(duì)NSCLC細(xì)胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 為了分析紫草素對(duì)NSCLC細(xì)胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，蛋白印跡檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白VEGF、MMP-14、Fn和Vimentin的表達(dá)。圖4A顯示，添加紫草素后A549細(xì)胞VEGF、MMP-14、Fn和Vimentin表達(dá)明顯減弱。統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)量，如圖4B所示，A549細(xì)胞VEGF的表達(dá)會(huì)隨著紫草素濃度的增加而減弱；紫草素組(20、50、100 mmol/L)MMP-14、Fn和Vimentin的表達(dá)也都低于對(duì)照組(P<0.05)。由此可見，紫草素可抑制NSCLC細(xì)胞A549上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖1 紫草素化學(xué)結(jié)構(gòu)式(A)和CCK-8檢測A549細(xì)胞活力(B)Fig.1 Chemical structure of shikonin(A)and cell viability was tested by CCK-8(B)

圖2 Transwell檢測細(xì)胞侵襲Fig.2 Cell invasion was detected by TranswellNote: A.Crystal violet staining ×100；B.The statistical histogram of the number of invasive cells per field,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs DMSO.

圖3 劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力Fig.3 Cell migration was measured by wound healing assayNote: A.Scratch space was photographed under inverted microscope ×40;B.The statistical histogram of the wound closure rate,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs DMSO.

2.5紫草素對(duì)NSCLC細(xì)胞A549中PI3K/AKT信號(hào)通路的影響 為探索紫草素影響NSCLC細(xì)胞A549的分子機(jī)制，蛋白印跡檢測PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白及抑癌基因p53的表達(dá)。圖5A顯示，添加PI3K/AKT通路激活劑IGF-1后，PI3K和p-AKT表達(dá)升高，p53表達(dá)降低；紫草素處理A549后，PI3K和p-AKT表達(dá)降低，p53表達(dá)升高。由圖5B可知，PI3K/AKT通路激活劑IGF-1可增強(qiáng)PI3K和p-AKT表達(dá)，降低p53表達(dá)(P<0.05)。與IGF-1組相比，紫草素組(20、50、100 mmol/L)PI3K和p-AKT表達(dá)降低，p53表達(dá)升高，逆轉(zhuǎn)IGF-1誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路的激活和p53表達(dá)的降低(P<0.05)。上述結(jié)果表明，紫草素可通過PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)A549進(jìn)行調(diào)控。

圖4 蛋白印跡檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of epithelial-mesenchymal transition related proteins was detected by Western blotNote: A.Representative picture of Western blot；B.The statistical histogram of the Western blot,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs DMSO.

圖5 蛋白印跡分析PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白和p53的表達(dá)Fig.5 Expression of PI3K/AKT pathway related proteins and p53 was tested by Western blotNote: A.Representative picture of Western blot；B.The statistical histogram of the Western blot.*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 vs A549 group；##.P<0.01,###.P<0.001 vs IGF group.

3 討論

肺癌一直以來都是發(fā)生率和死亡率最高的癌癥。全球肺癌病例從2002年的125萬上升到2012年的180萬，肺癌死亡人數(shù)從2002年的118萬增加到2012年的160萬[7,8]。而且肺癌的5年以上存活率十分低，在英國肺癌5年以上存活率僅為16.8%[9]。肺癌嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量且給衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來巨大的財(cái)政壓力，2010年英國用于肺癌的直接醫(yī)療成本約121億美元[10]。開發(fā)有效的且副作用小的肺癌治療方法對(duì)人類健康事業(yè)的發(fā)展具有重要意義。植物提取物由于其副作用小而在疾病治療方面受到廣泛關(guān)注。

大量文獻(xiàn)報(bào)道了植物提取物在抑制癌細(xì)胞活力方面起著積極作用。有數(shù)據(jù)顯示從金鐘柏樹葉中提取的黃酮醇可抑制A549細(xì)胞活力[11]。據(jù)報(bào)道，重樓皂苷處理A549后，細(xì)胞活力明顯減弱[12]。有研究發(fā)現(xiàn)紫草素可抑制胃癌細(xì)胞及人表皮樣癌A431細(xì)胞活力[13,14]。Huang等[15]發(fā)現(xiàn)紫草素還可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力。與前人結(jié)果類似，本研究結(jié)果顯示，NSCLC細(xì)胞A549細(xì)胞活力會(huì)隨著紫草素處理濃度的增加而降低。

癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力在癌癥發(fā)展進(jìn)程中具有重要作用。許多植物提取物都可以減弱癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。有研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物和紫蘇醇均可抑制A549細(xì)胞侵襲[16,17]。據(jù)報(bào)道栝樓果實(shí)可抑制A549細(xì)胞遷移及侵襲[18]。Hao等[19]研究顯示紫草素可減弱卵巢癌細(xì)胞侵襲能力。有研究數(shù)據(jù)顯示紫草素可抑制乳腺癌細(xì)胞及結(jié)腸直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移[20,21]。本研究結(jié)果表明，紫草素(20、50、100 mmol/L)可明顯減弱NSCLC細(xì)胞A549侵襲及遷移能力。

越來越多的文獻(xiàn)表明植物提取物可抑制癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Shi等[22]發(fā)現(xiàn)沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯可抑制尼古丁誘導(dǎo)的A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。有研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌細(xì)胞中，紫草素可減弱皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Vimentin及MMP-14的表達(dá)，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[23]。有數(shù)據(jù)顯示紫草素和替莫唑胺混合物可抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞Vimentin表達(dá)[24]。Hsieh等[25]發(fā)現(xiàn)紫草素可減弱肺癌細(xì)胞HCC827波形蛋白Vimentin的表達(dá)。與前人結(jié)果一致，本研究表明，紫草素(20、50、100 mmol/L)會(huì)降低A549細(xì)胞VEGF、MMP-14、Fn和Vimentin表達(dá)，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

大量數(shù)據(jù)表明抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，提高p53水平對(duì)癌癥的治療具有積極作用。有研究表明毛梗豨薟草提取物可通過抑制AKT的活化減弱A549細(xì)胞活力和侵襲能力[26]。有數(shù)據(jù)顯示丹參酮可降低NSCLC細(xì)胞Glc-82、A549和H460中AKT磷酸化水平，提高p53表達(dá)，減弱細(xì)胞活力[27]。據(jù)報(bào)道紫草素可通過PI3K/AKT信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞活力[28]。Zhang等[29]研究發(fā)現(xiàn)紫草素可通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路減弱膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲和遷移能力。本研究結(jié)果顯示，紫草素(20、50、100 mmol/L)可抑制A549細(xì)胞PI3K/AKT通路激活劑IGF-1誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路的激活和p53表達(dá)的降低。

本研究表明，紫草素可減弱A549細(xì)胞活力；降低細(xì)胞侵襲及遷移能力；減弱VEGF、MMP-14、Fn和Vimentin表達(dá)，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；逆轉(zhuǎn)PI3K/AKT通路激活劑IGF-1誘導(dǎo)的PI3K和p-AKT表達(dá)的升高及p53表達(dá)的降低。綜上所述，紫草素可通過PI3K/AKT通路實(shí)現(xiàn)對(duì)A549細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用。下一步計(jì)劃進(jìn)行紫草素抑制NSCLC的體內(nèi)研究，為發(fā)掘新的肺癌治療策略奠定基礎(chǔ)。