范增慧，馬鋒鋒，屈 杰,2，李小會(huì),2Δ

1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽712046)； 2.陜西省中醫(yī)藥管理局 傷寒學(xué)與經(jīng)方辨治疑難病重點(diǎn)研究室(咸陽 712046)

21世紀(jì)初，一種被稱為細(xì)胞焦亡的細(xì)胞死亡新方式在被沙門桿菌感染的巨噬細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[1]。研究[2]表明，細(xì)胞焦亡是一種病原誘導(dǎo)的、依賴炎性胱天蛋白酶1/4/5/11(cysteine-dependent aspartrate-specific proteases，Caspase-1/4/5/11)并伴隨炎癥反應(yīng)的細(xì)胞程序性死亡方式。炎性小體激活并活化下游底物天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)介導(dǎo)后續(xù)Gasdermin D(GSDMD)蛋白裂解是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵。已有研究[3]表明NOD樣受體家族3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRP3)、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)及活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)可通過半胱天冬酶(caspases)誘發(fā)細(xì)胞焦亡。而GSDMD蛋白是所有炎性caspases的共有底物，可獨(dú)立介導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等炎癥介質(zhì)的釋放。炎性caspases在特定位點(diǎn)通過裂解GSDMD，激活其打孔活性是焦亡細(xì)胞胞膜破裂、細(xì)胞崩解的效應(yīng)機(jī)制。免疫炎癥性疾病糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)由多種炎癥因子介導(dǎo)，炎癥反應(yīng)是其腎臟慢性損傷的重要因素。炎癥反應(yīng)貫穿細(xì)胞焦亡和DN全程，作為二者的中介，我們可從炎癥反應(yīng)角度實(shí)驗(yàn)探討DN與細(xì)胞焦亡的聯(lián)系與發(fā)生機(jī)制。細(xì)胞焦亡可通過外源性感染和內(nèi)源性損傷信號(hào)誘導(dǎo)自發(fā)炎癥性疾病DN炎癥反應(yīng)的發(fā)生，但研究尚處于起步階段。本綜述從炎癥小體激活caspase-1誘發(fā)炎癥介導(dǎo)細(xì)胞焦亡機(jī)制及GSDMD蛋白打孔的效應(yīng)機(jī)制角度闡述細(xì)胞焦亡在DN中的研究進(jìn)展。

1 細(xì)胞焦亡與凋亡

細(xì)胞焦亡具有的細(xì)胞核濃縮、染色體DNA降解等形態(tài)學(xué)特征和依賴Caspases激活的機(jī)制使其在研究初期易與凋亡混淆，但在生物學(xué)特征及分子機(jī)制上仍可與凋亡相鑒別。凋亡發(fā)生時(shí)伴隨的細(xì)胞皺縮、核固縮、凋亡小體形成一系列特征均不會(huì)破壞胞膜及細(xì)胞器。因此完整結(jié)構(gòu)的細(xì)胞胞質(zhì)無法外流，局部常無炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡區(qū)別于凋亡最顯著的特征是胞膜完整性破壞而后誘發(fā)的一系列炎癥反應(yīng)。一方面細(xì)胞焦亡時(shí)由于胞質(zhì)膨脹，胞膜受力不均，破裂形成1～2 nm的小孔隙，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外流，大量促炎因子釋放誘發(fā)炎癥反應(yīng)，細(xì)胞染料可由胞膜破損形成的小孔使細(xì)胞核著色，這一特征常可通過核DNA染色陽性來識(shí)別；另一方面細(xì)胞焦亡伴隨Caspase-1/4/5/11的激活并釋放IL-1β、IL-18,募集更多的炎癥細(xì)胞，擴(kuò)大局部和全身炎癥反應(yīng)。體內(nèi)外多種刺激信號(hào)使炎性小體發(fā)生應(yīng)答，受體蛋白Pro-caspases和Nod樣受體(Nod-like receptors,NLRs)通過接頭蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)連接或直接識(shí)別并結(jié)合細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)被激活，進(jìn)一步表達(dá)并催化IL-1β、IL-18合成、釋放，最終執(zhí)行焦亡任務(wù)[4]。細(xì)胞焦亡因依賴的炎性胱天蛋白酶不同而分為經(jīng)典和非經(jīng)典兩種途徑。病毒雙鏈DNA和ROS刺激激活NLRP3炎癥小體產(chǎn)生，NLRP3的選擇性應(yīng)答是高分子復(fù)合物Caspase-1形成的一種過程[5]，而Caspase-1是經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑必不可少的特異性依賴物。經(jīng)典焦亡時(shí)胞質(zhì)從破裂的胞膜外流及由核苷酸內(nèi)切酶所介導(dǎo)染色體DNA降解均依賴caspase-1的激活，這也成為經(jīng)典和非經(jīng)典細(xì)胞焦亡鑒別的重要生物學(xué)特征。非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡則依賴caspase-4/5/11受體,其在胞內(nèi)識(shí)別LPS隨后直接剪切其下游底物GSDMD蛋白形成一種環(huán)狀低聚物，該物質(zhì)通過在質(zhì)膜上打孔誘導(dǎo)細(xì)胞裂解死亡。近期研究[6]發(fā)現(xiàn)，由漿膜上控制小分子物質(zhì)進(jìn)出的Pannexin-1介導(dǎo)的離子通道開放可能是細(xì)胞焦亡的另一重要機(jī)制。研究[7]發(fā)現(xiàn)非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡通過Caspase-4/5/11誘導(dǎo)Pannexin-1斷裂，激活嘌呤能離子門控受體P2X7(purinergic receptor P2X，ligand-gated ion)打開胞膜通道，在細(xì)胞膜上形成小孔引起細(xì)胞內(nèi)離子梯度平衡失調(diào)，最終誘發(fā)細(xì)胞焦亡。Derangère等[8]在結(jié)腸癌研究中證實(shí)細(xì)胞外腺苷三磷酸可激活嘌呤能離子門控受體P2X7(purinergic receptor P2X，ligand-gated ion)打開胞膜通道介導(dǎo)炎性復(fù)合物的形成誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。另外，離子通道開放所導(dǎo)致的K+外流激活NLRP3炎癥小體是其誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的另一機(jī)制[9]。

2 細(xì)胞焦亡與炎癥反應(yīng)機(jī)制研究

2.1 細(xì)胞焦亡調(diào)控相關(guān)炎癥因子

對(duì)細(xì)胞焦亡超微結(jié)構(gòu)研究得知，細(xì)胞焦亡過程中胞膜上微孔和囊泡形成，細(xì)胞腫脹、破裂最終發(fā)生滲透性崩解，胞質(zhì)成分外流啟動(dòng)機(jī)體炎性反應(yīng)，使細(xì)胞焦亡成為特殊的細(xì)胞炎癥性死亡方式。機(jī)體啟動(dòng)炎性反應(yīng)是細(xì)胞焦亡的重要途徑，炎癥小體持續(xù)活化產(chǎn)生的相關(guān)白介素和促炎因子促進(jìn)細(xì)胞焦亡發(fā)生。因此研究炎癥反應(yīng)、炎性小體有助于了解細(xì)胞焦亡炎癥反應(yīng)的調(diào)控方式。細(xì)胞焦亡免疫反應(yīng)過程中的模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors，PRR)包括NLRs受體(NLRP1、NLRP3和NLRC4)、Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)和PYHIN蛋白(AIM2)，其均能直接或間接上調(diào)炎癥小體中心分子和IL-1β、IL-18 前體的表達(dá)。研究[10]已發(fā)現(xiàn)可介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的炎性小體有：NLRP3、NLRP1、NLRC4、AIM2和TLR4等。

2.1.1 NLRP3炎癥小體 炎癥小體的激活是細(xì)胞焦亡發(fā)生的關(guān)鍵，一些分布在胞漿中的NLRs家族可識(shí)別胞內(nèi)信號(hào)活化caspase-1。而NLRP3炎癥體是炎癥反應(yīng)的核心因子，作為固有免疫細(xì)胞內(nèi)的危險(xiǎn)信號(hào)感受器之一，目前研究最為廣泛和全面。NLRP3是一種包括支架蛋白NLR、銜接蛋白ASC和效應(yīng)蛋白炎性半胱天冬酶-1前體(pro cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Pro-caspase-1)等多個(gè)蛋白的復(fù)合物[11]，其可被多種內(nèi)源性或外源性配體激活促進(jìn)炎性因子IL-1β、IL-18的形成和分泌。復(fù)合蛋白NLRP3由LRR、NACHT及CARD或PYD 3部分組成[12]。這種結(jié)構(gòu)在炎性小體組裝和蛋白與蛋白間發(fā)揮作用尤其重要。接頭蛋白ASC特異性擁有PYD結(jié)構(gòu)域，有利于其與NLRP3中的PYD結(jié)構(gòu)結(jié)合進(jìn)行后續(xù)信號(hào)傳遞。ASC的特殊結(jié)構(gòu)為caspase-1的激活提供了一個(gè)平臺(tái)。研究[13]發(fā)現(xiàn)NLRP3的激活中ASC出現(xiàn)成核現(xiàn)象導(dǎo)致更多ASC募集。配體被LRR識(shí)別后組裝炎癥小體復(fù)合體，進(jìn)而活化NLRP3，接收信號(hào)后的NLRP3首先發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，使PYD與ASC發(fā)生作用，ASC可通過CARD-CARD和PYD-PYD結(jié)構(gòu)域相互作用完成NLRP3炎癥小體的裝配和pro-caspase-1的剪切和活化，從而募集Caspase-1介導(dǎo)IL-1β和IL-18的成熟和釋放，誘發(fā)炎癥反應(yīng)及啟動(dòng)細(xì)胞焦亡[14-15]。

NLRP3炎癥小體活化的上游機(jī)制與線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species，mROS)產(chǎn)生、鉀離子(K+)外流、溶酶體破裂及溶解有關(guān)[16]。氧化應(yīng)激始動(dòng)靶點(diǎn)-ROS可通過半胱天冬氨酸蛋白酶、溶酶體蛋白酶或內(nèi)切核酸酶的作用引起細(xì)胞焦亡、凋亡和自噬[17]。線粒體來源的ROS可激活NLRP3炎癥小體介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，因此ROS在細(xì)胞焦亡中的作用不可忽視。陳海燕[18]研究發(fā)現(xiàn)，鎘暴露下的血管內(nèi)皮細(xì)胞通過氧化應(yīng)激通路促進(jìn)線粒體ROS生成，激活NLRP3、增強(qiáng)caspase-1活性和IL-1β的產(chǎn)生介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。另有研究[19]表明活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸和經(jīng)小型干擾RNA沉默后的NLRP3或ASC可以有效抑制尼古丁誘導(dǎo)的caspase-1裂解、IL-18、IL-1β產(chǎn)生及原代人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。另外低濃度鉀離子環(huán)境可以活化NLRP3炎癥小體[20]。氯喹還可上調(diào)ATP1B3 的表達(dá)，抑制鉀離子外流，從而負(fù)調(diào)控NLRP3炎癥小體復(fù)合物裝配從而阻斷NLRP3后續(xù)的炎癥反應(yīng)及其介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[21]。一方面NLRP3炎癥小體作為宿主防御和識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(danger associated molecular pattern，DAMPs)的重要物質(zhì)，能保護(hù)機(jī)體免受病原微生物和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)的攻擊[22]；另一方面NLRP3通過介導(dǎo)促炎因子的水解、成熟和釋放啟動(dòng)過度炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡可對(duì)機(jī)體造成不可逆損傷。

2.1.2 NLRP1、NLRC4炎癥小體 同樣是Caspase-1炎性小體亞基的NLRP1、NLRC4與NLRP3的不同在于其含有CARD結(jié)構(gòu)域，過表達(dá)時(shí)可以不依賴ASC獨(dú)自結(jié)合Caspase-1傳導(dǎo)信號(hào)[23-24]。NLRP1基因的表達(dá)呈多樣性但卻是目前已知的唯一含有pyrin和CARD結(jié)構(gòu)域NLR。NLRP1中的Pyrin結(jié)構(gòu)域間接感知細(xì)菌毒素,使宿主細(xì)胞Rho家族小G蛋白失活進(jìn)而以PYD與ASC蛋白結(jié)合的方式組裝炎癥小體復(fù)合物，介導(dǎo)細(xì)胞天然免疫[25]。NLRP1的類型具有多樣性，其同系物眾多，僅是鼠源性NLRP1基因表達(dá)就包括3類：NLRP1a、NLRP1b、NLRP1c。Boyden等[26]發(fā)現(xiàn)，NLRP1b基因識(shí)別LeTx后活化Caspase-1，可誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)生。但小鼠巨噬細(xì)胞通過NLRP1b識(shí)別LeTx并不具特異性。如B6遺傳背景小鼠雖然能表達(dá)NLRP1a/b，但不能識(shí)別LeTx。研究[27]發(fā)現(xiàn)NLRP1在自身免疫性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中可通過上調(diào)IL-1β介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

NLRC4又稱IPAF，主要通過鞭毛蛋白(Flagellin)和三型分泌系統(tǒng)基體蛋白(PrgJ)參與機(jī)體抵抗革蘭陰性菌感染過程[28-29]。研究[30]證實(shí)NLRC4能識(shí)別鞭毛蛋白，可以在低水平細(xì)菌載量時(shí)參與銅綠假單胞菌感染后caspase-1的活化。NLRC4結(jié)構(gòu)域由N端CARD、C端LRR和中間NOD 3部分組成，正因其N端擁有與接頭蛋白ASC的相同CARD結(jié)構(gòu)域這一特征，使其不依賴接頭蛋白ASC可直接募集和活化caspase-1。但與NLRP1不同，ASC在NLRC4募集caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡過程中仍具有重要作用。在對(duì)被沙門桿菌感染的巨噬細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，NLRC4炎癥小體可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡。ASC缺乏的細(xì)胞死亡中Caspase-1的激活量有所減少，白細(xì)胞介素IL-1β的分泌量也隨之減少，這說明ASC在NLRC4激活的反應(yīng)中非必須，但其擁有的CARD結(jié)構(gòu)域會(huì)影響促炎反應(yīng)和細(xì)胞死亡反應(yīng)的劇烈程度[31]。

2.1.3 Toll樣受體蛋白4-TLR4 Toll樣受體4是一類包含N端和C端的I型跨膜蛋白受體。TLR4可識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的PAMPs誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)，該過程與脂多糖(LPS)激活TLR4-N端的亮氨酸富集重復(fù)序列有關(guān)；TLR4-C端是一個(gè)包含Toll/IL-1的受體結(jié)構(gòu)域，其信號(hào)傳導(dǎo)途徑與諸多白細(xì)胞介素具有同源性，因此LPS/TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成為激活下游信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡的研究熱點(diǎn)。TLR4是由脂多糖、輔助受體髓系分化抗原、LRR結(jié)構(gòu)蛋白CD14構(gòu)成的三聚體受體，常通過啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)釋放腫瘤壞死因子、IL-6、IL-8等[32]。TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是一個(gè)通過裝配NLRP3炎癥小體的間接過程。NLRP3的激活途徑按有無TLR4的參與分為經(jīng)典和非經(jīng)典兩種途徑。TLR4作為NLRP3經(jīng)典的激活通路，其能通過MyD88促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞中NLRP3的脫泛素化調(diào)控細(xì)胞焦亡的發(fā)生[33]。經(jīng)典過程為TLR4信號(hào)通路激活,促進(jìn)NLRP3和Pro-IL-1β轉(zhuǎn)錄水平升高，介導(dǎo)IL-1β和IL-18前體產(chǎn)生預(yù)激活階段和NLRP3/ASC/pro-caspase-1蛋白復(fù)合物組裝, pro-caspase-1自剪切并活化成caspase-1隨后發(fā)揮作用的修飾激活兩個(gè)階段[34]。非經(jīng)典過程由Caspase-4/5/11識(shí)別LPS,將Gasdermin D蛋白切割成C端、N端兩部分直接啟動(dòng)細(xì)胞焦亡,不依賴TLR4信號(hào)通路。

Toll樣受體的表達(dá)具有多樣性，其能夠在多種細(xì)胞中表達(dá)。LPS對(duì)TLR4誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等刺激炎癥因子的釋放，激活機(jī)體有效的免疫應(yīng)答。LPS由結(jié)合蛋白LBP運(yùn)送到單核及巨噬細(xì)胞胞膜表面上，再與其受體分子TLR4、CD14、MD-2共同作用，誘導(dǎo)TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和其他生物學(xué)效應(yīng)[35]。組織來源的CD4+T細(xì)胞能夠發(fā)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，這些細(xì)胞能表達(dá)高水平的前體IL-1β以及NLRP3炎癥體[36]。近期研究[37]發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞不僅能釋放促炎因子擴(kuò)大炎癥反應(yīng)還能激活NLRP3活化Caspase-1介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。HIV感染過程中CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)生焦亡而引起炎癥反應(yīng)。研究[38]發(fā)現(xiàn)使用caspase-1抑制劑可阻斷CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)生焦亡，保持其數(shù)目穩(wěn)定以維持正常免疫功能。在對(duì)由ATP處理和耶爾森菌感染所引起的NLR激活的caspase-1研究發(fā)現(xiàn)，NLRs與TLRs均可增強(qiáng)其敏感性引起細(xì)胞內(nèi)caspase-1的激活并產(chǎn)生大量的IL-1β和IL-18，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)[39-41]。

2.1.4 AIM2炎癥小體 黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)屬ALRs家族成員，作為權(quán)威的炎性小體其結(jié)構(gòu)包括C末端HIN和N端PYD結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn),AIM2的激活機(jī)制與核周聚集體相關(guān)，接頭蛋白ASC與N-PYD結(jié)合與此聚集體息息相關(guān)。其C-HIN結(jié)構(gòu)域?？芍苯优c病毒、細(xì)菌dsDNA結(jié)合,利用N-PYD結(jié)構(gòu)與ASC結(jié)合活化Caspase-1，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。高度特異性的細(xì)胞焦亡，最初是在細(xì)胞急性損傷檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，其與NLRs或AIM2啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)、胞外PAMPs有關(guān)。NLRs和AIM2可以觸發(fā)由ASC和pro-Caspase-1蛋白復(fù)合物的形成，并處理信號(hào)以誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[42]。AIM2炎性體在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，研究[43]證明缺氧缺血性腦損傷鼠巨噬細(xì)胞中，AIM2的Pyrin結(jié)構(gòu)域氨基酸可與ASC結(jié)合，對(duì)caspase-1 活化和IL-1β釋放啟動(dòng)免疫應(yīng)答引起細(xì)胞焦亡。AIM2有助于caspase-1的激活，但AIM2調(diào)控細(xì)胞焦亡的相關(guān)機(jī)制尚未完全明了。

2.2 焦亡執(zhí)行終點(diǎn)蛋白-GSDMD

GSDMD蛋白是Gasdermin家族的一員，在免疫細(xì)胞和小腸黏膜上皮細(xì)胞表面廣泛表達(dá)。GSDMD蛋白是所有炎性 Caspase 的共同底物蛋白，GSDMD只能由炎性Caspase激活特異性參與焦亡發(fā)生。實(shí)驗(yàn)證實(shí)活化的炎性Caspase能夠在Asp276 位點(diǎn)上特異性裂解切割GSDMD蛋白，引起下游炎性反應(yīng)因子IL-18，IL-1β的成熟和釋放，激發(fā)炎性反應(yīng)及細(xì)胞焦亡，從而奠定了GSDMD蛋白作為炎性Caspase底物在細(xì)胞焦亡中所發(fā)揮的重要作用。細(xì)胞焦亡時(shí)GSDMD被炎性Caspase切割形成GSDMD-N和GSDMD-C結(jié)構(gòu)域，并發(fā)生低聚化。切割產(chǎn)物N端稱效應(yīng)域是發(fā)揮焦亡的主要功能結(jié)構(gòu)域，它具有親脂性和成孔活性。N端能選擇性與質(zhì)膜的內(nèi)膜及細(xì)菌的膜結(jié)合，病原體因胞膜的破壞直接死亡;另一方面蛋白打孔后宿主細(xì)胞膜破裂病原體被釋放到內(nèi)環(huán)境中，被宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別殺傷。親脂性表現(xiàn)在N端能特異性與細(xì)胞上的脂質(zhì)結(jié)合錨定于生物膜上發(fā)揮破壞作用。研究[44]對(duì)DSDMD的打孔性進(jìn)行了驗(yàn)證，細(xì)胞焦亡時(shí)GSDMD-N不會(huì)從細(xì)胞膜外破壞細(xì)胞的活性，而是與膜結(jié)合破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致胞膜內(nèi)外環(huán)境滲透性紊亂，最終保護(hù)屏障丟失細(xì)胞溶脹破裂。C端具有親水性，對(duì)細(xì)胞焦亡具有阻遏作用，靜息狀態(tài)下C 端與N端通過長(zhǎng)環(huán)相結(jié)合是其抑制細(xì)胞焦亡的基礎(chǔ)。Ding、Sborgi等[45-46]在實(shí)驗(yàn)中分別發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生焦亡后，GSDMD的N端在脂質(zhì)體上形成蛋白孔洞，顯微鏡下其直徑大約10～20nm。Chen等[47]還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形成類似“凋亡小體”的“焦亡小體”樣突起。GSDMD介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的機(jī)制還在于其能影響IL-1β/18 的釋放。韓家淮團(tuán)隊(duì)研究證實(shí)無論經(jīng)典或非經(jīng)典途徑的細(xì)胞焦亡都必須依賴焦亡執(zhí)行蛋白GSDMD的介導(dǎo)。細(xì)胞中敲除GSDMD后，Pro-IL-1β仍可被Caspase-1切割成有活性的IL-1β，但細(xì)胞焦亡被抑制，回補(bǔ)GSDMD后細(xì)胞焦亡仍可發(fā)生。這可能與敲除GSDMD阻止了炎性因子分泌至細(xì)胞外有關(guān)[48]。結(jié)果表明GSDMD與IL-1β的成熟無關(guān)，但卻是成熟IL-1β、IL-18釋放分泌到胞外的必要條件。這也證實(shí)了GSDMD對(duì)于細(xì)胞裂解和炎性反應(yīng)擴(kuò)大的必要性。

3 細(xì)胞焦亡與糖尿病腎病

DN是一種代謝炎癥性疾病。炎癥反應(yīng)在DN慢性腎臟損傷的發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。腎臟固有細(xì)胞：腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞和足細(xì)胞的損傷在炎癥介導(dǎo)的DN發(fā)病及疾病進(jìn)展中發(fā)揮至關(guān)重要作用。焦亡細(xì)胞的典型特征炎性小體表達(dá)增加、Caspase-1激活及下游促炎因子的大量釋放等又能反向?qū)е翫N細(xì)胞死亡增加，可以從炎癥反應(yīng)作為突破口探討DN與細(xì)胞焦亡的發(fā)生機(jī)制。

DN病程中腎臟固有細(xì)胞的減少或缺失會(huì)導(dǎo)致腎損傷及影響腎小球?yàn)V過屏障過濾的正常發(fā)揮出現(xiàn)蛋白尿。而細(xì)胞焦亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白ASC、NLRP3、Caspase-1等均與DN腎臟固有細(xì)胞死亡息息相關(guān)。急性缺血性腎損傷時(shí)NLRP3/caspase-1軸激活，炎癥因子和分子釋放導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞形成大量孔洞，細(xì)胞焦亡率顯著增加,而使用siNLRP3腺病毒抑制NLRP3及其他白介素表達(dá)后焦亡細(xì)胞顯著減少[49]。線粒體功能障礙是腎臟的缺血再灌注損傷(H/R)疾病中腎小管上皮細(xì)胞損傷的早期事件，H/R損傷時(shí)線粒體平衡蛋白DRP1表達(dá)上調(diào)，活性氧增加，ROS通過NLRP3誘發(fā)炎癥介導(dǎo)焦亡。使用線粒體分裂抑制劑(Mdivi-1)能有效減少活性氧產(chǎn)生，抑制腎小管上皮細(xì)胞焦亡發(fā)生，保護(hù)腎臟功能。線粒體功能障礙是腎小球足細(xì)胞損傷的早期事件,可通過阻斷線粒體ROS/NLRP3通路，阻止DN細(xì)胞炎癥反應(yīng)及焦亡發(fā)生。研究證實(shí)，DN的高血糖癥及氧化應(yīng)激等可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體分解代謝增加，活性氧積聚增多，觸發(fā)NLRP3炎性小體途徑，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生焦亡。DN病程中高糖、高胰島素等造成的細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷等又是細(xì)胞焦亡的危險(xiǎn)因素。研究[50]證實(shí)miR-497可靶向定位NLRP1直接或間接調(diào)節(jié)TLR4和NF-kB炎性小體, caspase-1 水平，減少白細(xì)胞介素IL-1β的表達(dá)抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞。李嶸等[51]研究發(fā)現(xiàn)miR-497抑制糖尿病并發(fā)癥細(xì)胞焦亡是通過靶定NLRP1實(shí)現(xiàn)，miR-497靶定NLRP1并降低NLRP1-3'UTR報(bào)告基因的螢光素酶活性抑制其表達(dá)，最終抑制腎小球系膜細(xì)胞焦亡。于艷等[52]研究發(fā)現(xiàn)，高糖高胰島素培養(yǎng)的HRMC細(xì)胞焦亡增多伴隨NLRP1炎癥小體激活增加。利用Western Blot、RT-PCR檢測(cè)各組48 h時(shí)間段細(xì)胞焦亡相關(guān)炎癥因子NLRP1、IL-1β、TNF-α、caspase-1 水平等發(fā)現(xiàn)，炎癥因子在蛋白表達(dá)及mRNA水平表達(dá)上與對(duì)照組相比均上調(diào)。而后對(duì)HRMC轉(zhuǎn)染NLRP1 小干涉RNA(siNLRP1)后，與非轉(zhuǎn)染組相比發(fā)現(xiàn)NLRP1 蛋白水平明顯降低，而后NLRP1炎癥反應(yīng)軸上的各個(gè)炎癥因子的mRNA 和蛋白水平均較非轉(zhuǎn)染組明顯降低。

4 小結(jié)與展望

炎癥小體被激活，而后介導(dǎo)下游介質(zhì)Caspase-1活化，最終命令終端核心蛋白GSDMD執(zhí)行打孔效應(yīng)是細(xì)胞焦亡發(fā)生過程中必不可少的幾個(gè)環(huán)節(jié)。關(guān)鍵物質(zhì)炎癥小體在細(xì)胞焦亡中不可或缺。炎性小體激活的途徑包括：細(xì)胞自噬異常、線粒體ROS異常產(chǎn)生及某些金屬離子離子態(tài)平衡失調(diào)等。如前所述吞噬溶酶體紊亂也參與了NLRP3炎癥小體的激活，但其上游機(jī)制是否與細(xì)胞焦亡的激活相關(guān)聯(lián)，是否也參與細(xì)胞焦亡進(jìn)程還有待研究。細(xì)胞焦亡作為細(xì)胞生命終結(jié)的特殊形式，猶如一把“雙刃劍”適度的細(xì)胞焦亡有利于保護(hù)機(jī)體抵抗內(nèi)外源性危險(xiǎn)因素?fù)p傷；另一方面，炎癥反應(yīng)劇烈細(xì)胞焦亡過度也是臨床疾病發(fā)生和機(jī)體嚴(yán)重病理損傷的主要因素。炎性小體、胱天蛋白酶在DN細(xì)胞焦亡研究中已有所涉及，但研究尚淺；而Caspase底物蛋白GSDMD在DN研究中仍未涉及，其是否發(fā)揮作用，怎樣發(fā)揮作用依然未知。我們應(yīng)在完善目前已有研究成果的基礎(chǔ)上，深化打孔效應(yīng)機(jī)制研究的動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步揭示細(xì)胞焦亡調(diào)控所涉及的新機(jī)制及其與DN的關(guān)系，為DN防護(hù)和治療提供新靶點(diǎn)。