劉曉娉，黃睿

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣州 510655)

自從輔助生殖技術(shù)的出現(xiàn)，排卵障礙、內(nèi)分泌異常、盆腔炎性疾病等不孕患者的生育難題得到了很大程度的解決。但高齡婦女的助孕結(jié)局一直不盡人意，近幾十年的研究結(jié)果提示導(dǎo)致高齡女性生育能力下降的主要因素是卵子老化[1]。線(xiàn)粒體是卵子內(nèi)含量最多的細(xì)胞器，能產(chǎn)生ATP和多種生物合成中間體，為卵子的成熟、受精及胚胎發(fā)育過(guò)程提供能量，同時(shí)參與細(xì)胞內(nèi)多種生命活動(dòng)過(guò)程，如維持鈣離子穩(wěn)態(tài)、胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝等。

在單個(gè)原始生殖細(xì)胞中線(xiàn)粒體數(shù)量<10個(gè)，在卵子發(fā)育成熟過(guò)程中，其線(xiàn)粒體數(shù)量增至1×106個(gè)以上，這提示線(xiàn)粒體數(shù)量和功能可作為衡量卵子質(zhì)量的重要指標(biāo)[2]。與年輕女性相比，高齡女性卵子中的線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)突變率明顯增高而拷貝數(shù)及線(xiàn)粒體膜電位明顯降低[3-4]，理論上改善線(xiàn)粒體功能和/或增加正常線(xiàn)粒體數(shù)量可以提高老化卵子質(zhì)量，改善其發(fā)育潛能。自1997年將健康女性的卵細(xì)胞漿注射入質(zhì)量差的卵子中并獲得活產(chǎn)的案例報(bào)道以來(lái)，各種線(xiàn)粒體替代治療和線(xiàn)粒體移植技術(shù)相繼問(wèn)世，其中包括原核移植、紡錘體移植、極體移植、自體顆粒細(xì)胞線(xiàn)粒體移植、自體卵原前體細(xì)胞線(xiàn)粒體移植、自體脂肪干細(xì)胞線(xiàn)粒體移植、自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞線(xiàn)粒體移植等。然而由于安全隱患及倫理問(wèn)題等因素，這些技術(shù)的臨床應(yīng)用推廣備受爭(zhēng)議。同時(shí)，我們對(duì)線(xiàn)粒體移植的作用機(jī)制了解甚少。本文將闡述線(xiàn)粒體與卵子質(zhì)量之間的關(guān)系，進(jìn)而介紹線(xiàn)粒體移植在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展歷史和分析其可能的作用機(jī)制。

一、線(xiàn)粒體與卵子質(zhì)量

線(xiàn)粒體是半自主性細(xì)胞器，呈扁長(zhǎng)形，由外膜、內(nèi)膜、嵴和基質(zhì)構(gòu)成。人類(lèi)線(xiàn)粒體遺傳物質(zhì)(mtDNA)長(zhǎng)約16.6 kb，呈雙鏈環(huán)狀，無(wú)組蛋白，其包含37個(gè)基因，編碼2種線(xiàn)粒體rRNA、22種tRNA和13種氧化磷酸化酶復(fù)合體蛋白亞基。線(xiàn)粒體是卵子胞質(zhì)中數(shù)量最多的細(xì)胞器，不僅為卵子成熟、受精及胚胎發(fā)育過(guò)程提供能量，同時(shí)調(diào)控鈣離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡自噬等生命活動(dòng)過(guò)程，其數(shù)量及功能異常將會(huì)對(duì)卵子受精和胚胎發(fā)育結(jié)局造成影響。

1.mtDNA拷貝數(shù)與卵子質(zhì)量：mtDNA拷貝數(shù)在不同類(lèi)型細(xì)胞中存在差異。與體細(xì)胞相比，成熟卵子mtDNA含量至少多一個(gè)數(shù)量級(jí)。在卵子發(fā)生、囊胚發(fā)育及著床后發(fā)育等階段都有mtDNA復(fù)制活動(dòng)[5]。原始生殖細(xì)胞中含有約200個(gè)mtDNA拷貝數(shù)，隨著卵子發(fā)生，線(xiàn)粒體數(shù)量和mtDNA拷貝數(shù)均逐漸增加，直至卵子成熟完成受精時(shí)mtDNA拷貝數(shù)達(dá)到峰值；在囊胚發(fā)育階段，總體mtDNA拷貝數(shù)逐漸減少，但與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)相比，滋養(yǎng)外胚層中的mtDNA拷貝數(shù)顯著增加，而內(nèi)細(xì)胞團(tuán)則維持低水平的mtDNA復(fù)制。著床前期參與原腸胚形成的胚胎干細(xì)胞mtDNA開(kāi)始復(fù)制，余未分化細(xì)胞內(nèi)mtDNA數(shù)量隨著細(xì)胞復(fù)制而減少，稱(chēng)為“mtDNA稀釋”；直至著床后期，mtDNA稀釋停止，因已積累了足夠量的mtDNA，未分化細(xì)胞發(fā)揮新的特定的細(xì)胞功能[6]。

成熟卵子中需要有充足的mtDNA拷貝數(shù)，從而確保在胚胎著床后，每個(gè)子細(xì)胞有足夠的mtDNA用于復(fù)制重啟，為著床后的胚胎發(fā)育過(guò)程提供足夠的能量。該mtDNA拷貝數(shù)下限值即為卵子發(fā)育能力的關(guān)鍵閾值，在人類(lèi)該閾值為100 000[7]。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，mtDNA拷貝數(shù)減少導(dǎo)致胚胎囊胚形成率下降[8]；而成功體外受精卵的平均mtDNA拷貝數(shù)也顯著高于未成功受精卵的mtDNA拷貝數(shù)[3]。這說(shuō)明卵子中的mtDNA拷貝數(shù)影響其發(fā)育潛能和受精能力，增加線(xiàn)粒體數(shù)量可能提高發(fā)育潛能、增強(qiáng)受精能力。因此，線(xiàn)粒體數(shù)量或mtDNA拷貝數(shù)可以作為衡量卵子質(zhì)量?jī)?yōu)劣的標(biāo)志之一。

2.mtDNA突變與卵子質(zhì)量：mtDNA缺少組蛋白，鄰近的電子傳遞鏈能產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，且mtDNA的修復(fù)酶能力有限，使其容易發(fā)生突變，mtDNA的突變率是核基因的25倍[9]。突變mtDNA的聚集可以通過(guò)影響呼吸鏈功能干擾卵子的成熟。在卵子成熟過(guò)程中，微管和細(xì)胞分裂活動(dòng)的必要能量由線(xiàn)粒體提供。一旦呼吸鏈功能受到損傷，ATP產(chǎn)生減少，線(xiàn)粒體不能提供足夠的能量，就會(huì)干擾紡錘體上微管蛋白聚合和解聚，影響減數(shù)分裂染色體的分離，影響卵子質(zhì)量。

目前為止，研究人員已經(jīng)找出超過(guò)150種不同的mtDNA突變方式。早在1993年，Kitagawa等[10]首次發(fā)現(xiàn)人類(lèi)卵巢組織存在mtDNA4977 bp缺失，且隨著年齡的增加，其缺失率也明顯增加。之后Keefe等[11]證實(shí)與年輕女性相比，高齡女性有更高的mtDNA 4977 bp缺失率，且認(rèn)為這與其生育潛能低下有關(guān)。除此之外，Hsieh等[12]在人卵中檢測(cè)到了另外12種mtDNA缺失，并認(rèn)為mtDNA缺失可導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙和ATP生成受損，從而干擾卵子受精和進(jìn)一步的胚胎發(fā)育。機(jī)體在有氧代謝過(guò)程中伴隨著ROS的產(chǎn)生隨著年齡的增加機(jī)體所累積的ROS會(huì)增加，高齡婦女卵子中高濃度的ROS以及受損的抗氧化防御機(jī)制使得mtDNA的突變率增高，進(jìn)而引發(fā)受精率低、胚胎發(fā)育異常及反復(fù)流產(chǎn)等不良結(jié)局[13]。

3.氧化應(yīng)激與卵子質(zhì)量：線(xiàn)粒體在產(chǎn)生ATP的同時(shí)伴隨著ROS的產(chǎn)生。正常情況下，機(jī)體內(nèi)氧化水平和抗氧化水平處于一種動(dòng)態(tài)平衡中。研究表明，適量的ROS參與卵泡發(fā)育、卵子成熟、排卵、黃體生成和卵泡閉鎖等生理活動(dòng)過(guò)程[14]。機(jī)體內(nèi)ROS與抗氧化劑之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)卵子正常生長(zhǎng)發(fā)育有著重要的作用，機(jī)體的抗氧化能力隨著年齡增長(zhǎng)而減弱，隨之面臨的是ROS的積累。過(guò)多的ROS可破壞線(xiàn)粒體內(nèi)膜的極性孔(mPT)，導(dǎo)致鈣離子和細(xì)胞色素C外流，造成線(xiàn)粒體膜電位消失，線(xiàn)粒體凋亡程序啟動(dòng)導(dǎo)致減數(shù)分裂周期停滯和細(xì)胞凋亡[15]，在胚胎中則表現(xiàn)為卵裂球溶解及細(xì)胞碎片增多。另外，高濃度ROS抑制鈉鈣交換體和鈣離子信號(hào)分子鈣調(diào)蛋白活性，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池儲(chǔ)存鈣離子減少而細(xì)胞質(zhì)中鈣離子增加，打破原有的鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡[16]，最終致使卵子凋亡。研究報(bào)道，與形態(tài)正常的胚胎相比，出現(xiàn)細(xì)胞碎片的胚胎中ATP和ROS水平顯著升高[17]；對(duì)小鼠MⅡ期卵進(jìn)行光致敏造成線(xiàn)粒體損傷后，后續(xù)的胚胎發(fā)育及胎鼠的出生率均受到影響[18]。

線(xiàn)粒體在卵子成熟、受精及胚胎發(fā)育過(guò)程中有著至關(guān)重要的作用，線(xiàn)粒體數(shù)量不足和(或)功能障礙都將影響妊娠結(jié)局。線(xiàn)粒體治療的出現(xiàn)為這類(lèi)問(wèn)題的解決提供了新的方向。

二、線(xiàn)粒體治療發(fā)展歷史

1.線(xiàn)粒體替代療法：線(xiàn)粒體替代療法(mitochondrial replacement therapy，MRT)，即用健康的外源性線(xiàn)粒體補(bǔ)充或替代卵子或合子內(nèi)異常的線(xiàn)粒體，可以改善卵子質(zhì)量提高其發(fā)育潛能，但其產(chǎn)生的安全隱患和倫理問(wèn)題引發(fā)爭(zhēng)議。早在1997年，Cohen等[19]首次將健康女性的卵細(xì)胞漿注射到反復(fù)卵子質(zhì)量差的患者卵子中并獲得活產(chǎn)。次年，Van Blerkom等[20]將卵子中富含線(xiàn)粒體的胞質(zhì)分離并注射入另一MⅡ期卵中，發(fā)現(xiàn)受體卵子ATP含量增加且保持一定的活性。但引入外來(lái)的胞質(zhì)會(huì)帶來(lái)異質(zhì)性的安全問(wèn)題，同時(shí)胞質(zhì)內(nèi)含有的其他生物成分是否會(huì)對(duì)卵子造成傷害也是未知的。隨著克隆技術(shù)的發(fā)展，除了卵胞質(zhì)移植外，原核移植(pronuclei transfer，PNT)、生發(fā)泡移植(germinal vesicle transfer，GVT)、紡錘體移植(spindle transfer，ST)及極體移植(polar body transfer，PBT)等技術(shù)相繼出現(xiàn)。2016年，世界首例“三親嬰兒”于墨西哥誕生，該案例正是利用ST技術(shù)后進(jìn)行輔助生殖技術(shù)助孕并最終產(chǎn)出子代。然而，外源性線(xiàn)粒體的引入可導(dǎo)致后代攜帶兩種不同來(lái)源的線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體的異質(zhì)性或許可以通過(guò)表觀遺傳影響子代的性狀，可能給子代帶來(lái)即時(shí)或長(zhǎng)期的健康隱患。同時(shí)，由于第三方遺傳物質(zhì)的引入所形成的“三親嬰兒”也勢(shì)必會(huì)引起法律和倫理上的爭(zhēng)議。

2.線(xiàn)粒體移植技術(shù)：線(xiàn)粒體移植技術(shù)，即體外分離供體細(xì)胞的線(xiàn)粒體，將其通過(guò)顯微注射注入MⅡ期卵子。既避免了分離卵胞質(zhì)和核移植等技術(shù)要求高的問(wèn)題，也可利用自體細(xì)胞作為供體，最大程度減少了后續(xù)的倫理問(wèn)題，現(xiàn)已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

Tzeng等[21]在2001年首次報(bào)道了自體顆粒細(xì)胞來(lái)源線(xiàn)粒體移植入卵子并成功妊娠的案例?？琢罴t等[22]的研究表明自體顆粒細(xì)胞線(xiàn)粒體移植可明顯改善胚胎發(fā)育質(zhì)量，提高妊娠率。加拿大OvaScience公司分離患者卵巢里的卵原前體細(xì)胞(卵巢干細(xì)胞)，從中分離提取線(xiàn)粒體注射入卵子中，并進(jìn)行體外受精，誕生了世界上首個(gè)“干細(xì)胞嬰兒”。2015年，Oktay等[23]對(duì)10位反復(fù)助孕失敗的患者進(jìn)行卵原前體細(xì)胞線(xiàn)粒體移植，臨床妊娠率達(dá)40%。但Labarta等[24]的一項(xiàng)卵原前體細(xì)胞線(xiàn)粒體移植隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示這項(xiàng)技術(shù)并不能改善妊娠結(jié)局，盡管該研究利用分子標(biāo)記物對(duì)線(xiàn)粒體供體細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，但并不能完全明確其細(xì)胞性質(zhì)，同時(shí)研究報(bào)道也沒(méi)有明確其注射線(xiàn)粒體拷貝數(shù)的定量方法及具體注射劑量，因此并不能據(jù)此否定其對(duì)人類(lèi)卵子質(zhì)量的改善作用。2018年梁曉燕團(tuán)隊(duì)報(bào)道了首例應(yīng)用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的線(xiàn)粒體移植入卵子后，行輔助生殖技術(shù)助孕并成功活產(chǎn)男嬰的案例[25]。除了臨床研究以外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞或自體脂肪組織來(lái)源的線(xiàn)粒體移植入卵子后均可以明顯提高老齡小鼠卵子的發(fā)育潛能[26-27]。

三、線(xiàn)粒體移植改善卵子質(zhì)量的可能機(jī)制

卵子中線(xiàn)粒體過(guò)少或mtDNA突變會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能異常，影響卵子成熟、受精及胚胎發(fā)育，理論上增加線(xiàn)粒體數(shù)量或改善線(xiàn)粒體功能可以提高卵子質(zhì)量，改善妊娠結(jié)局。已有文獻(xiàn)表明，分離純化的線(xiàn)粒體可以快速、直接進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并正常發(fā)揮自身功能[28]。那么，線(xiàn)粒體移植后是如何改善卵子質(zhì)量的？下面就幾種可能的作用機(jī)制進(jìn)行闡述。

ATP的產(chǎn)生依賴(lài)于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上一條完整的氧化呼吸鏈復(fù)合體。氧化呼吸鏈的損傷將導(dǎo)致ROS水平上升，ATP水平下降。Tarin等[29]提出卵子老化的“氧自由基——線(xiàn)粒體損傷學(xué)說(shuō)”，認(rèn)為隨著年齡的增長(zhǎng)，卵子內(nèi)會(huì)堆積過(guò)多的ROS繼而影響ATP的生成，能量生成受阻會(huì)干擾紡錘體微管蛋白的聚合解聚過(guò)程，染色體分離過(guò)程受到影響，從而導(dǎo)致非整倍體的發(fā)生。將體外分離的線(xiàn)粒體注射入卵子后，增加了mtDNA的拷貝數(shù)，增加ATP的生成[29]，使微管蛋白聚合和解聚過(guò)程的能量得以補(bǔ)充，減少卵子非整倍體的發(fā)生，從而提高卵子發(fā)育潛能。

線(xiàn)粒體具有高度的活動(dòng)性，可以連續(xù)不斷地進(jìn)行融合與分裂。線(xiàn)粒體的融合與分裂平衡對(duì)維持線(xiàn)粒體正常形態(tài)、功能有重要作用。線(xiàn)粒體融合蛋白Mfn2對(duì)小鼠卵子成熟至關(guān)重要[30]，當(dāng)敲除線(xiàn)粒體融合基因后可導(dǎo)致卵子成熟障礙，胚胎發(fā)育潛能及相應(yīng)的胚胎質(zhì)量下降。老化卵子中高濃度的ROS促進(jìn)線(xiàn)粒體分裂，從而破壞線(xiàn)粒體的數(shù)量平衡。高齡女性卵子與年輕女性卵子相比，線(xiàn)粒體分裂活動(dòng)更加旺盛，從而產(chǎn)生更多的線(xiàn)粒體碎片[31]。過(guò)多的線(xiàn)粒體分裂活動(dòng)可通過(guò)ROS/NF-kB信號(hào)通路上調(diào)基質(zhì)相互作用分子(STIM1)表達(dá)和鈣池操縱性鈣內(nèi)流從而導(dǎo)致胞漿鈣離子濃度增加[32]。眾所周知，依賴(lài)于鈣離子的釋放和/或積累的信號(hào)通路在動(dòng)物胚胎的各種發(fā)育進(jìn)程中起著重要作用，可影響細(xì)胞的分化命運(yùn)和形態(tài)。外源性線(xiàn)粒體進(jìn)入卵子后，可能重新調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體融合和分裂的穩(wěn)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度，使得細(xì)胞各項(xiàng)生理活動(dòng)得以正常進(jìn)行，從而改善老化卵子質(zhì)量，提高其發(fā)育潛能。

另一方面，老化卵子中ROS的積累導(dǎo)致氧化損傷，導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙和細(xì)胞損傷[33]，其中過(guò)量的ROS累積會(huì)影響線(xiàn)粒體自噬。ROS調(diào)控線(xiàn)粒體自噬的機(jī)制包括ROS-PINK1/Parkin、ROS-HIF1-BNIP3/Nix、ROS-FOXO3-LC3/BNIP3和ROS-NRF2-P62等通路[34-37]。Niu等[38]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PINK1的下調(diào)誘導(dǎo)線(xiàn)粒體伸長(zhǎng)和腫脹，降低線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)，導(dǎo)致ATP缺乏，顯著增加自噬和凋亡，顯著影響囊胚的形成和質(zhì)量。ROS作為PINK1/Parkin通路的上游信號(hào)分子，老化卵子內(nèi)高濃度的ROS是否下調(diào)了PINK1的表達(dá)使自噬功能受損最終導(dǎo)致卵子發(fā)育潛能變差，以及外源性線(xiàn)粒體是否通過(guò)重新調(diào)控線(xiàn)粒體自噬而改善卵子質(zhì)量，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去探索。

四、展望

在近二十幾年里，輔助生殖技術(shù)有了巨大的進(jìn)步，但卵子老化及胚胎質(zhì)量低下仍然是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題，越來(lái)越多的學(xué)者將目光聚焦在線(xiàn)粒體移植治療上，但目前對(duì)線(xiàn)粒體移植治療的臨床應(yīng)用所帶來(lái)的倫理和安全問(wèn)題存在爭(zhēng)議。關(guān)于線(xiàn)粒體移植療法的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)及基礎(chǔ)研究相對(duì)較少，其有效性和安全性也需要更多的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。