劉利民,姚松梅,李 洋*

(1.正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司南京研究院，江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 )

老鸛草為牻牛兒苗科植物牻牛兒苗Erodium stephanianum Wild、老鸛草Geranium wilfordii Maxim，或野老鸛草Geranium carolinianum L.的干燥地上部分。其味辛、苦，性平，具有祛風(fēng)濕，活血，止瀉痢等功效，可用于治療筋骨疼痛，痹癥，麻木，泄瀉痢疾等病癥[1]。鞣質(zhì)和黃酮類是其重要藥效成分，鞣質(zhì)是一種多元酚類化合物，此類化合物具有收斂、抑菌、抗病毒、抗氧化、降血壓等作用[2]；黃酮類天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血糖等作用。因此，開發(fā)利用老鸛草的藥用植物資源，優(yōu)化老鸛草總鞣質(zhì)與總黃酮的提取工藝，對(duì)擴(kuò)大其應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。目前，對(duì)鞣質(zhì)與總黃酮的提取多采用超聲和回流提取，多數(shù)對(duì)溶劑的濃度與用量、提取時(shí)間、液料比、提取溫度等進(jìn)行考察研究。本文總結(jié)了提取鞣質(zhì)和總黃酮的多種工藝方法，以期為更好地開發(fā)利用老鸛草資源奠定基礎(chǔ)。

1 鞣質(zhì)的提取

鞣質(zhì)的提取方法有多種，主要有回流提取法、纖維素酶酶解法、水溫浸法、超聲提取法、超臨界CO2提取法。以相關(guān)物質(zhì)的提取率為指標(biāo)，考察對(duì)提取率產(chǎn)生影響的各因素，從而確定最佳提取工藝。

1.1 回流提取法

尹海波等[3]比較了乙醇熱回流、乙醇冷浸及甲醇超聲三種提取方式，發(fā)現(xiàn)從提取效率和節(jié)約成本的角度，乙醇熱回流方法最優(yōu)。采用正交設(shè)計(jì)法，以沒食子酸的提取率為考察指標(biāo)，考察對(duì)提取率產(chǎn)生較大影響的四因素，即乙醇的濃度與用量，提取次數(shù)與提取時(shí)間，最終確定提取工藝為30倍30%乙醇提取3次，每次1h。通過(guò)設(shè)計(jì)驗(yàn)證性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)使用該提取工藝后，鞣質(zhì)的提取效率較高，操作可控，節(jié)省物料。而辛聰?shù)萚4]以紫外分光光度法測(cè)定的鞣質(zhì)含量為指標(biāo)，調(diào)整提取溫度，采用均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)考察乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度和乙醇用量四因素，用回流法提取老鸛草中的鞣質(zhì)。優(yōu)選出最佳提取工藝為乙醇濃度40%，提取兩次，溶劑用量24倍(12倍、12倍)，提取時(shí)間6h(3h，3h)，提取溫度80℃，老鸛草中鞣質(zhì)的提取量為3.498%。李京杰等[5]通過(guò)單因素試驗(yàn)研究鞣質(zhì)提取率的影響因素，包括提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度等。利用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)老鸛草總鞣質(zhì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，采用三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化出老鸛草總鞣質(zhì)的最佳提取工藝條件為：老鸛草粉末與71%乙醇的比例1∶18于83℃恒溫回流2h，提取3次，鞣質(zhì)的提取率為13.55%，與之前鞣質(zhì)提取率相比有了提高。谷靜逸等[6]用50%甲醇、水、75%乙醇作為考察溶劑，采用回流的提取方式，設(shè)計(jì)了3種實(shí)驗(yàn)方案：50%甲醇回流2次；水回流2次；75%乙醇回流1次與水回流1次混合。結(jié)果表明，75%乙醇和水各回流1次后既能使老鸛草素水解完全，又能讓樣品中諸如柯里拉京、沒食子酸成分的含量不被降低，所以采用75%乙醇+水各回流提取1次后混合提取鞣質(zhì)。與谷靜逸選擇的提取方法相反，李祎等[7]選擇水回流提取，而且該工藝明顯提高了主要活性成分總鞣質(zhì)的提取率，總鞣質(zhì)提取率高達(dá)25.29%。實(shí)驗(yàn)不僅僅將總鞣質(zhì)含量作為考察指標(biāo)，還將浸膏得率和柯里拉京含量納入考察依據(jù)，對(duì)影響因素如提取的溶劑、溫度、時(shí)間、次數(shù)以及加水量等進(jìn)行考察，確定老鸛草總鞣質(zhì)的最佳提取工藝為：老鸛草粉末+20倍量的水于100℃下回流2h，回流兩次。

1.2 酶解法

酶解法在工藝操作、工藝成本、設(shè)備要求等方面都優(yōu)于有機(jī)溶劑提取中藥成分。酶解法適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，并且酶解法提取率高。鄭玲玲等[8]以用比色法測(cè)定的鞣質(zhì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用纖維素酶酶解法提取老鸛草中的鞣質(zhì)。將纖維素酶用量、酶解時(shí)間和酶解溫度作為考察因素，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。最終確定的最佳提取工藝為：酶用量為10U/g，酶解溫度為60℃，酶解時(shí)間為60min。在不加酶的情況下，按照工藝條件進(jìn)行水提取，結(jié)果根據(jù)吸光度值可判斷酶解法優(yōu)于水提法。

1.3 水溫浸法

鞣質(zhì)的極性較強(qiáng)，所以提取溶劑選擇極性較大的水和有機(jī)溶劑。閻巧娟等[9]采用水回流法、水溫浸法、丙酮回流法、冷浸攪拌法和乙醇回流法提取老鸛草中的鞣質(zhì)。水回流較水冷浸提取率高，但鞣質(zhì)遇熱易氧化變性，所以水回流不適合作為提取鞣質(zhì)的最佳方法。采用水溫浸法、丙酮回流法和乙醇回流法提取的鞣質(zhì)的含量都較高，但水溫浸法具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，所以最終將水溫浸法作為提取鞣質(zhì)的最佳方式。王放銀等[10]通過(guò)正交試驗(yàn)確定影響鞣質(zhì)提取的主要因素為料水比，其次是浸提溫度，最后是浸提時(shí)間，優(yōu)選出最佳工藝條件為：料水比1∶30、浸提溫度80℃、浸提時(shí)間30min。

1.4 超聲提取法

與傳統(tǒng)的溫浸提取法相比，循環(huán)超聲法提取率高，提取時(shí)間短，溶劑用量少。鄭明昱等[11]采用干酪素法測(cè)定鞣質(zhì)含量，考察提取溶劑、提取時(shí)間、超聲功率等因素對(duì)鞣質(zhì)提取率的影響，確定工藝條件為12倍量40%乙醇超聲提取1h，間隔超聲比0.6∶0.5s，超聲功率500W，并且設(shè)計(jì)溫浸提取對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果鞣質(zhì)提取率明顯低于該超聲提取法。鞣質(zhì)提取后需要進(jìn)行分離純化，減壓分離提取溶劑。因?yàn)轺焚|(zhì)極性強(qiáng)且50℃以上易氧化，因此應(yīng)該采用沸點(diǎn)低且同樣具有較強(qiáng)極性的溶劑，所以史偉國(guó)等[12]選擇極性強(qiáng)、沸點(diǎn)低的丙酮作為提取溶劑。將老鸛草粉末置于丙酮溶液中浸泡后于常溫下超聲，提取鞣質(zhì)。考察丙酮的適宜濃度及用量，浸泡和提取的時(shí)間，以總鞣質(zhì)含量為指標(biāo)，用EDTA絡(luò)合法滴定。最終從耗時(shí)和節(jié)能的角度選定提取工藝為：用30%丙酮10倍量浸泡12h超聲提取60min。鄭玲玲等[13]利用明膠沉淀老鸛草中總鞣質(zhì)，再利用丙酮溶解明膠沉淀物中總鞣質(zhì)，初步純化出老鸛草中總鞣質(zhì)類成分。也有學(xué)者采用12%交聯(lián)瓊脂糖凝膠吸附色譜法一步分離純化了老鸛草中可水解的鞣質(zhì)，采用5%乙醇和5%乙酸組成的流動(dòng)相A和30%乙醇和30%乙酸組成的流動(dòng)相B梯度洗脫法進(jìn)行分離，純度及產(chǎn)率都較高[14]。

1.5 超臨界CO2提取法

有學(xué)者為了優(yōu)化超臨界CO2提取老鸛草中鞣質(zhì)的工藝條件，用磷鉬鎢酸-干酪素比色法測(cè)定鞣質(zhì)的含量，以老鸛草鞣質(zhì)的提取含量為指標(biāo)，考察提取壓力、提取溫度和提取時(shí)間三個(gè)影響因素，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定最佳工藝條件為：提取壓力25MPa，提取溫度為500℃，提取時(shí)間為1.5 h[15]。

2 總黃酮的提取

黃酮類化合物一般難溶或不溶于水，可溶于甲醇，乙醇等有機(jī)溶劑，所以總黃酮的提取多用乙醇作為提取溶劑。目前老鸛草總黃酮的提取可采用回流提取法、超聲提取法、乙醇滲漉法、微波輔助乙醇萃取法。

2.1 回流提取法

王洪成等[16]采用先水回流再乙醇回流的方法使老鸛草素充分水解同時(shí)又可提取出黃酮類成分。朱明慧等[17]通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化老鸛草總黃酮的提取工藝。以總黃酮得率為指標(biāo)，用單因素試驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、回流時(shí)間、溶劑用量和提取溫度四因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理優(yōu)化出總黃酮的提取工藝為：加35倍量65%乙醇于90℃回流提取2次，每次70min。尹海波等[18]比較了超聲提取法、乙醇冷浸法、乙醇回流法，結(jié)果超聲提取法、乙醇冷浸法和乙醇回流法所得樣品中總黃酮的平均含量依次為0.0964%、0.0906%、0.4687%。相比而言乙醇回流提取的總黃酮得率較高，所以采用乙醇回流法設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。以老鸛草藥材總黃酮的提取率為指標(biāo)，考察對(duì)總黃酮提取率產(chǎn)生較大影響的四因素：乙醇濃度及其用量，回流時(shí)間和回流次數(shù)，最終將提取工藝優(yōu)化為4倍量90%乙醇提取3次，每次1h。杜列勇等[19]首先確定了提取所用的乙醇濃度為60%，在確定醇濃度的基礎(chǔ)上，依據(jù)總黃酮的提取量，選擇乙醇用量、提取時(shí)間和提取溫度為考察因素，再設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定提取總黃酮的最佳工藝條件為：老鸛草粉末加20倍量的60%乙醇于80℃下回流75min。在預(yù)試中發(fā)現(xiàn)，一定時(shí)間內(nèi)，提取出的有效成分隨著時(shí)間的增加而增加，提取出的雜質(zhì)也隨時(shí)間的增長(zhǎng)而相應(yīng)增多。一定時(shí)間過(guò)后，總黃酮提取率不再明顯增加但雜質(zhì)仍繼續(xù)增多，所以為了便于提取后的分離純化，選擇回流75min。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，該工藝條件可行且可以作為大生產(chǎn)的參考工藝條件。

2.2 超聲提取法

周慶頌等[20]采用乙醇超聲提取總黃酮，比較了30%～90%乙醇等不同提取溶劑，發(fā)現(xiàn)70%乙醇超聲提取黃酮的總含量較高且干擾雜質(zhì)最少，所以用70%乙醇作為提取溶劑，超聲提取總黃酮。但是也有學(xué)者認(rèn)為60%乙醇提取總黃酮的量相對(duì)較多，劉青林等[21]先對(duì)所用溶劑進(jìn)行了50%、60%、70%、75%、80%五個(gè)乙醇濃度對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)用60%乙醇提取總黃酮的量較多，溶液雜質(zhì)較少，所以確定選用60%乙醇提取。之后劉青林等比較了回流、超聲、滲漉這三種提取方式，發(fā)現(xiàn)超聲法提取的總黃酮量較多且從操作的角度考慮，超聲法提取總黃酮操作更為方便。

2.3 乙醇滲漉法

秦哲等[22]為了獲得經(jīng)濟(jì)實(shí)用的老鸛草中黃酮類物質(zhì)的提取方法，以乙醇為提取溶劑，分別運(yùn)用滲漉法與超聲提取法提取老鸛草中總黃酮類化合物，用比色法測(cè)定總黃酮含量，并對(duì)兩種提取方法進(jìn)行了比較。雖然試驗(yàn)結(jié)果與劉青林所下的結(jié)論一致，超聲提取法提取的總黃酮的量高于滲漉法，但綜合提取效率、提取成本等因素，秦哲等認(rèn)為乙醇滲漉法更適合老鸛草總黃酮的提取。

2.4 微波輔助乙醇萃取法

微波萃取技術(shù)不同于傳統(tǒng)萃取技術(shù)，它速度快，往往只需要幾分鐘，提取率高且試驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性好。趙志添等[23]將過(guò)篩的老鸛草粉末置于一定量的乙醇溶液中萃取，將提取液在一定的微波功率下微波處理一段時(shí)間，過(guò)濾完全后，用明膠沉淀法除去濾液中的鞣質(zhì)，得到總黃酮。先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定適宜的乙醇濃度、液料比以及微波參數(shù)如功率、時(shí)間等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度在40%～90%時(shí)，總黃酮得率先增后減，在乙醇濃度為70%時(shí)，總黃酮得率最高；液料比在10～30mL/g時(shí)，總黃酮得率先明顯增加，液料比到達(dá)20mL/g后再增加液料比，總黃酮得率增加不明顯，接近平穩(wěn)，所以液料比在20mL/g時(shí)既能節(jié)省物料又能使提取出的總黃酮的量接近最多；隨著微波功率的增大，總黃酮得率先升后降，微波功率在385W時(shí)，總黃酮得率為最大值；雖然微波時(shí)間延長(zhǎng)可能會(huì)使反應(yīng)更加完全，總黃酮的提取率升高，但是超出合適的微波時(shí)間后，提取液會(huì)噴濺從而造成損失，微波時(shí)間處于2min時(shí)可使提取率達(dá)到最高。再設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以確定對(duì)總黃酮得率產(chǎn)生影響的因素的主次。最終確定的最佳工藝條件為乙醇濃度70%，液料比20mL/g，微波時(shí)間2min，微波功率385W。

3 總結(jié)與展望

老鸛草在我國(guó)資源豐富，分布廣泛，其主要活性成分鞣質(zhì)和總黃酮的提取方法有多種，即使提取方式相同，選用的提取溶劑濃度用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度不同，也會(huì)造成提取率的不同。就回流提取法提取鞣質(zhì)而言，影響因素的選擇不同，就會(huì)造成鞣質(zhì)得率3.498%、6.32%、13.55%、25.29%的差異。因此，不僅要考察提取方式也要重視影響因素的考察研究。先進(jìn)提取技術(shù)的發(fā)展，將極大地提高老鸛草鞣質(zhì)與總黃酮的提取效率，提取工藝的不斷優(yōu)化也將使老鸛草具有良好的應(yīng)用前景。