鄭 欣， 劉 盟， 常占瑛， 馬桂枝， 聶昌宏， 阿依居來(lái)克·卡得爾， 李欣榮， 高曉黎

(新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院； 2附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部， 烏魯木齊 830011)

石榴皮為石榴科植物石榴(PunicaranatumL.)的干燥果皮，味酸澀，藥性溫，其中主要的化學(xué)成為多酚類物質(zhì)，含量可達(dá)25%～30%[1]，具有抗炎[2]、抗腫瘤[3]的藥理作用；臨床多用于糖尿病[4]、腹瀉、痢疾、瘧疾以及腸道感染等多種疾病的治療[5-7]。安石榴苷(punicalagin)是石榴皮多酚的主要成分，是石榴皮多酚類中分子量最大的化合物，具抗氧化、抑菌、抗癌等生物活性[8-10]。近年來(lái)中藥及其有效成分引起肝臟損傷的病例越來(lái)越多[11]。肝臟是人體重要的代謝器官，是藥物毒性作用的主要靶向器官，大多數(shù)藥物的不良反應(yīng)都會(huì)引發(fā)肝臟的損傷[12]。有研究表明，不同劑量石榴果皮提取物會(huì)對(duì)小鼠造成肝臟損傷[13]。LO2肝細(xì)胞是藥物對(duì)人體肝損傷及機(jī)制研究的重要體外模型，利用體外肝細(xì)胞模型評(píng)估中藥的肝毒性與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)存在良好的相關(guān)性[14]。本實(shí)驗(yàn)采用體外肝細(xì)胞模型，測(cè)定石榴皮多酚純化物對(duì)LO2肝細(xì)胞的損傷作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1儀器KS12型生物安全柜(美國(guó)Thermo公司)，HERAcell 150i型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，SDPTOP型倒置顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)，4K1S型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)，Multiskan GO型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，C2型激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)

1.2試劑RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：AD21582265)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：1699800)，胰蛋白酶消化液(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：J170041)，雙抗(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：J150038)，PBS緩沖液(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：AC13716274)，CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(日本Dojindo公司，批號(hào)：KR675)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物有限公司，批號(hào)：20180808)，Hoechhst-33258染色液(中國(guó)Solarbio公司，批號(hào)：20171208)

1.3細(xì)胞人正常肝細(xì)胞系LO2(上海中喬新舟生物科技有限公司)。

1.4藥材石榴皮2017年9月購(gòu)自和田麥迪森藥業(yè)有限公司，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為石榴科石榴屬植物石榴(PunicagranatumL.)的干燥果皮。石榴皮多酚純化物(新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，安石榴苷含量HPLC≥82%)。

2 方法

2.1LO2肝細(xì)胞培養(yǎng)將LO2肝細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-鏈霉素抗體的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每1～2天觀察細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞密度，更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～85%時(shí)，用0.25%胰酶消化液對(duì)其進(jìn)行消化、傳代；在LO2肝細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2CCK8法檢測(cè)石榴皮多酚純化物對(duì)LO2肝細(xì)胞的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2肝細(xì)胞，0.25%胰酶消化液進(jìn)行消化，用含10%FBS和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基配制細(xì)胞懸液，按5×103/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)于37℃恒溫、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，加入不同濃度的石榴皮多酚純化物(藥物濃度為：3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000、200.000 μg/mL)，并設(shè)置陰性組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，藥物干預(yù)24 h，每空加10 μL的CCK8試劑，放置培養(yǎng)箱孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，計(jì)算藥物對(duì)LO2肝細(xì)胞的細(xì)胞活力，細(xì)胞存活率/%=(藥物組平均OD值/陰性組平均OD值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3細(xì)胞培養(yǎng)液中肝功能指標(biāo)測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2肝細(xì)胞，用0.25%胰酶消化液進(jìn)行消化，用含10%FBS和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基配制細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)于37℃恒溫、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，棄培養(yǎng)液，加入不同濃度的石榴皮多酚純化物(藥物濃度為：12.5、50.0、100.0 μg/mL)，并設(shè)置陰性組，藥物干預(yù)24 h后，吸取培養(yǎng)液，2 500 r/min離心10 min，收集上清液，按照ALT、AST、ALP試劑盒操作說(shuō)明，測(cè)定LO2肝細(xì)胞上清液中的ALT、AST、ALP指標(biāo)的含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4Hoechst-33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2肝細(xì)胞，用0.25%胰酶消化液進(jìn)行消化，用含10%FBS和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，接種于4孔板中，培養(yǎng)于37℃恒溫、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，加入不同濃度(12.5、50.0、100.0 μg/mL)的石榴皮多酚純化物，設(shè)置陰性組(只加等量的培養(yǎng)基)，藥物干預(yù)24 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入300 μL的Hoechst-33258工作液，37℃孵育30 min，棄染色液，用PBS緩沖液沖洗2次，隨后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察LO2肝細(xì)胞的凋亡情況并拍照。

3 結(jié)果

3.1石榴皮多酚純化物對(duì)LO2肝細(xì)胞存活率的影響與陰性組比較，不同濃度藥物組的OD值減小，不同濃度藥物組的細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

3.2石榴皮多酚純化物對(duì)LO2肝細(xì)胞ALT、AST、ALP含量的影響與陰性組比較，不同濃度藥物組干預(yù)LO2肝細(xì)胞24 h后，LO2培養(yǎng)液中ALT、AST、ALP的含量均降低(P<0.05)，見圖1-3。

3.3石榴皮多酚對(duì)LO2肝細(xì)胞凋亡的影響激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，藥物培養(yǎng)干預(yù)24 h后，陰性組細(xì)胞少見凋亡，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)輪廓清晰且細(xì)胞呈分散均勻的低強(qiáng)度藍(lán)光；藥物組活細(xì)胞數(shù)量隨給藥濃度增大無(wú)明顯變化，細(xì)胞形態(tài)正常，僅有少量細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)縮聚形成凋亡小體呈亮藍(lán)色熒光，見圖4。

表1 石榴皮多酚純化物對(duì)正常肝細(xì)胞LO2的增殖抑制率

注：與陰性組比較，**P<0.01。

圖1 石榴皮多酚純化物對(duì)ALT指標(biāo)的影響

A: 陰性組

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以LO2肝細(xì)胞為研究對(duì)象，研究石榴皮多酚純化物對(duì)LO2肝細(xì)胞的損傷作用，初步評(píng)價(jià)石榴皮多酚純化物的體外安全性。藥物細(xì)胞毒性的常規(guī)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)包括細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞代謝等[15-16]。體外細(xì)胞肝毒性通常表現(xiàn)在正常肝細(xì)胞活力下降、細(xì)胞形態(tài)受損、細(xì)胞膜受損通透性增加[17]；評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)影響最常用方法為ATP、MTT、CCK8法[18]，細(xì)胞膜的完整性通過檢測(cè)相關(guān)酶類的含量[19]。本研究結(jié)果表明石榴皮多酚純化物濃度小于100 μg/mL時(shí)，不會(huì)對(duì)LO2肝細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用，當(dāng)濃度大于100 μg/mL時(shí)，LO2肝細(xì)胞的存活率下降，可能是因?yàn)楦邼舛仁衿ざ喾蛹兓锏纳锘钚杂绊懙搅薒O2肝細(xì)胞生長(zhǎng)，但均未達(dá)到IC50，表明石榴皮多酚純化物對(duì)LO2肝細(xì)胞無(wú)毒性作用。相關(guān)酶(ALT、AST、ALP)的含量是評(píng)價(jià)肝損傷的主要生物指標(biāo)[15]，本研究通過測(cè)定肝功能相關(guān)酶ALT、AST、ALP的含量，發(fā)現(xiàn)石榴皮多酚純化物不會(huì)損傷LO2肝細(xì)胞膜而導(dǎo)致相關(guān)酶的含量增高，說(shuō)明石榴皮多酚純化物對(duì)LO2肝細(xì)胞無(wú)損傷作用。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在某些藥物等因素的干預(yù)下，通過調(diào)控細(xì)胞基因及產(chǎn)物所引起的程序性死亡；本研究通過Hoechst-33258染色法觀察，石榴皮多酚純化物干預(yù)LO2肝細(xì)胞后，LO2肝細(xì)胞的形態(tài)均正常，僅在高劑量藥物組可見少量細(xì)胞核縮聚，染色加深，亮藍(lán)色熒光的凋亡小體形成，表明石榴皮多酚純化物對(duì)LO2肝細(xì)胞的無(wú)明顯凋亡作用。綜上所述，石榴皮多酚純化物對(duì)體外培養(yǎng)LO2肝細(xì)胞無(wú)明顯損傷影響，為石榴皮多酚純化物的后續(xù)安全應(yīng)用提供了理論依據(jù)。