藍(lán)蔚青,鞏濤碩,陳夢(mèng)玲,王蒙,謝晶*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海,201306)3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專(zhuān)業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海，201306)；4(上海海洋大學(xué)，食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海，201306)

微生物生物被膜(biofilm, BF)為微生物在特定條件下形成的一種特殊群體結(jié)構(gòu)，是無(wú)柄微生物群落附著在各種載體上，通過(guò)分泌多糖、纖維蛋白與脂質(zhì)蛋白等胞外基質(zhì)，將載體包繞其中而形成的大量高度組織化、系統(tǒng)化的膜樣聚合物[1]。微生物菌體被包裹在其自身分泌的胞外聚合基質(zhì)(extracellular polymeric substances，EPS)中，具有特定結(jié)構(gòu)，是微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一種非游離狀態(tài)的微生物細(xì)胞集合體[2]。多糖、蛋白質(zhì)、磷脂、磷壁酸與核酸等是EPS的主要組分[3]。相對(duì)于以浮游方式存在的微生物，更多微生物以生物被膜形式存在[4]。其還包括原生動(dòng)物、真菌以及多種生物復(fù)合而形成的生物被膜[5]。與浮游方式存在的微生物相比，微生物為適應(yīng)生存環(huán)境形成的生物被膜危害更大、抗性更強(qiáng)、抑制或消滅也更困難。本文介紹了微生物生物被膜的形成過(guò)程與水產(chǎn)品中微生物的生物被膜現(xiàn)象，并對(duì)其控制措施予以說(shuō)明，提出相應(yīng)的問(wèn)題與解決方案，以期為后期相關(guān)研究提供理論參考。

生物被膜中含有腐敗菌與病原菌，其增加了水產(chǎn)品后處理的污染和對(duì)公眾健康的風(fēng)險(xiǎn)。目前，在水產(chǎn)品中能形成生物被膜的常見(jiàn)微生物主要有沙門(mén)氏菌、嗜水氣單胞菌、弧菌與單增李斯特菌等[6]。由于這些微生物被膜的存在，構(gòu)成了世界范圍內(nèi)的食品安全威脅。因此，控制水產(chǎn)品及其加工過(guò)程中的腐敗菌和病原菌污染，防止其生成生物被膜進(jìn)而交叉污染水產(chǎn)品，對(duì)控制一些食源性疾病的發(fā)生具有重要意義。其中，細(xì)菌生物被膜的動(dòng)態(tài)形成過(guò)程復(fù)雜，包括初始細(xì)菌的附著粘附、群落形成、生物被膜的成熟與細(xì)菌的分散污染[7]。細(xì)菌的附著和粘附是生物被膜形成的第一階段與關(guān)鍵步驟。在細(xì)胞能結(jié)合到表面前，其表面通過(guò)吸附來(lái)自周?chē)h(huán)境的分子而被調(diào)節(jié)。此外，吸附粘附取決于正在進(jìn)行的食品加工的類(lèi)型，可能在水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)中發(fā)現(xiàn)的有機(jī)物質(zhì)(肌鈣蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白)，其組成將不同于乳制品工業(yè)中表面上沉積的有機(jī)物質(zhì)(α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和α-乳清蛋白)，從而影響細(xì)胞保留與后續(xù)生物膜的結(jié)構(gòu)功能[8-10]。在生物被膜的成熟階段，微生物包裹其自身分泌的多聚糖基質(zhì)中，由扁平不均一結(jié)構(gòu)變?yōu)楦叨冉M織化結(jié)構(gòu)[11]。最后，微生物細(xì)胞分散污染其他表面，重復(fù)循環(huán)，形成新的生物被膜，這也是微生物生物被膜難以控制的主要原因。

1 水產(chǎn)品中存在的生物被膜現(xiàn)象

生鮮水產(chǎn)品含水量高、營(yíng)養(yǎng)豐富，其在貯藏與加工過(guò)程中極易受到污染，滋生微生物，形成微生物生物被膜，導(dǎo)致其腐敗，這已成為水產(chǎn)品及加工品中存在的主要問(wèn)題。

1.1 水產(chǎn)品原料

水產(chǎn)品原料自身帶有微生物源，當(dāng)細(xì)菌在水產(chǎn)品中形成生物被膜時(shí)，其會(huì)長(zhǎng)時(shí)間存活，并對(duì)多數(shù)抗菌產(chǎn)品表現(xiàn)出抗性[12]。細(xì)菌群體中含有對(duì)抗菌產(chǎn)品敏感性降低的亞群體，其可通過(guò)適應(yīng)，產(chǎn)生遺傳抗性元件，形成生物被膜并獲得更高抗性，微生物生物被膜特殊的三維生物結(jié)構(gòu)是抗菌產(chǎn)品的天然屏障[13]。細(xì)菌生物被膜主要由微生物、微生物分泌的黏性物質(zhì)和胞外多糖組成，其中微生物占比少于1/3。蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA與磷脂等生物大分子同細(xì)菌存在于生物被膜中，約占其總量的3%，另有97%的水分[14]。暴露于環(huán)境中的高濃度細(xì)菌與病毒可能形成生物被膜，并能長(zhǎng)時(shí)間處于穩(wěn)定狀態(tài)。但當(dāng)與環(huán)境和食物有關(guān)的因素給予這些生物被膜一定刺激時(shí)，其又回到浮游狀態(tài)[15]。如嗜水氣單胞菌已從螃蟹、鯽魚(yú)與鯧魚(yú)等水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品中分離出，該菌會(huì)引發(fā)食用人群產(chǎn)生敗血癥等疾病[16]。PANISELLO等[17]也關(guān)注了貝類(lèi)和其他海產(chǎn)魚(yú)類(lèi)中污染的沙門(mén)氏菌形成生物被膜引起的食源性疾病。

1.2 水產(chǎn)品加工過(guò)程

在水產(chǎn)品加工過(guò)程中，主要污染源通常是由于水產(chǎn)品加工設(shè)備的清潔和消毒不當(dāng)造成。水產(chǎn)環(huán)境中，沙門(mén)氏菌來(lái)源于帶菌者的糞便污染、水產(chǎn)品養(yǎng)殖環(huán)境及生產(chǎn)過(guò)程中的一系列環(huán)節(jié)[18]。其中，THOMPSON等[19]報(bào)道了由于金槍魚(yú)壽司卷的消費(fèi)感染沙門(mén)氏菌，引起食物中毒的現(xiàn)象。食源性病原菌可在設(shè)備材料表面、地面、工廠(chǎng)天花板等表面形成微生物生物被膜。在產(chǎn)品表面也可能存在病原菌，進(jìn)一步形成生物被膜。全球范圍內(nèi)，水產(chǎn)品傳播的疾病主要由霍亂弧菌、副溶血性弧菌或創(chuàng)傷弧菌等引起?；【鷮僦械母比苎曰【侵饕吃葱圆≡?，其在亞洲國(guó)家尤為如此[20]。海產(chǎn)品在制造、處理和加工過(guò)程中會(huì)受到產(chǎn)毒或非產(chǎn)毒霍亂弧菌污染[21]。其中，單增李斯特菌在熏海鮮、蝦、軟體動(dòng)物貝類(lèi)等各種水產(chǎn)品中被檢出，其可形成生物被膜，造成更大危害[22]。

2 水產(chǎn)品中微生物生物被膜的控制措施

為確保水產(chǎn)品安全，水產(chǎn)品生態(tài)系統(tǒng)的每一步都需采取相應(yīng)措施對(duì)生物被膜加以控制。主要方法有物理法、化學(xué)法、化學(xué)生物學(xué)法等。

2.1 物理法

(1)高壓處理：高壓處理可通過(guò)破壞微生物生物被膜的結(jié)構(gòu)，達(dá)到消毒和殺菌目的，一般可用于水產(chǎn)品加工處理。其中，莘似韻等[23]使用高于300 MPa的超高壓處理從水產(chǎn)品中分離的單增李斯特菌生物被膜，發(fā)現(xiàn)有2株4 b血清型細(xì)菌的生物被膜形成量都有顯著降低。高壓處理在某些情況能使牡蠣中總活菌、乳酸菌、大腸菌群等數(shù)量減少約5個(gè)對(duì)數(shù)單位，400 MPa、600 s是殺滅牡蠣中總菌數(shù)的最佳條件[24]。從現(xiàn)有分析得知，超高壓技術(shù)在水產(chǎn)品基礎(chǔ)研究與產(chǎn)品項(xiàng)目開(kāi)發(fā)上仍處于起步階段，實(shí)際操作可配合酶處理與熱加工等手段，拓展超高壓技術(shù)在水產(chǎn)品加工中的使用領(lǐng)域[25]。

(2)超聲波處理：超聲波處理具有設(shè)備要求低、使用方便、處理迅速，且對(duì)原料及操作人員傷害極低等特點(diǎn)，在水產(chǎn)品加工業(yè)中應(yīng)用前景廣闊，現(xiàn)已逐漸應(yīng)用于各類(lèi)食品加工中。目前，超聲波處理在消除細(xì)菌生物被膜方面應(yīng)用廣泛。相關(guān)報(bào)道顯示，超聲波處理能簡(jiǎn)單有效去除微生物生物被膜，使其風(fēng)險(xiǎn)最小化，且能提高產(chǎn)品的一致性與綜合質(zhì)量[26]。其中，黃靜等[27]使用超聲波處理120 s，能消除多數(shù)金黃色葡萄球菌形成的生物被膜，且易于控制，人為影響較小。盡管較低頻率的超聲波在降低生物被膜內(nèi)的細(xì)菌存活力方面較高頻率更有效，但使用現(xiàn)有的超聲波技術(shù)不能僅消除水產(chǎn)品及加工過(guò)程中的微生物，因此可將超聲波技術(shù)與其他處理技術(shù)相結(jié)合[28]。

2.2 化學(xué)法

(1)消毒劑：在水產(chǎn)品加工過(guò)程中消毒劑可減少細(xì)菌在非生物表面形成生物膜，其是清除細(xì)菌生物被膜的必要條件[29]。在水產(chǎn)品行業(yè)中，要有符合要求的清潔和消毒設(shè)施，使用消毒劑須安全有效、易于處理、無(wú)殘留。常用消毒劑有臭氧、過(guò)氧化氫、氯、苛性堿、過(guò)氧乙酸、碘與異噻唑啉酮等。其中，李長(zhǎng)青等[30]研究得出，鄰苯二甲醛消毒劑對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌與枯草桿菌黑色變種芽孢殺滅效果較好。但與浮游細(xì)胞相比，生物被膜對(duì)消毒劑的抗性更強(qiáng)。

(2)天然抗菌劑：從芳香族植物中提取的一些抗菌化合物天然安全，現(xiàn)已證明對(duì)浮游細(xì)菌具有良好的抗微生物活性[31]。如植物精油的次生代謝物具有抗微生物作用，其主要作用于微生物細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)雙層[32]。相關(guān)報(bào)道顯示，肉桂精油處理可使水產(chǎn)品生產(chǎn)加工中不銹鋼表面上的無(wú)固定細(xì)胞數(shù)量減少2.54個(gè)數(shù)量級(jí)，肉桂醛被證明能完全殺滅細(xì)菌或使其菌數(shù)明顯減少，現(xiàn)已成為商業(yè)化學(xué)消毒劑的有效替代品[33]。

2.3 化學(xué)生物學(xué)法

(1)噬菌體：噬菌體在大自然中無(wú)處不在，是感染和裂解細(xì)菌的病毒，可控制霍亂弧菌、鏈球菌和大腸埃希氏菌等人類(lèi)病原體，現(xiàn)已提議作為生物膜的控制方法之一[34]。許多噬菌體都會(huì)產(chǎn)生解聚酶，通過(guò)EPS擴(kuò)散，產(chǎn)生的解聚酶會(huì)水解生物被膜中的胞外聚合物，引發(fā)其破壞[35]。因此，需要進(jìn)一步評(píng)估噬菌體在控制水產(chǎn)品傳播的病原體方面的用途，改善水產(chǎn)品的安全性。但噬菌體的宿主范圍很窄，因此噬菌體混合物或工程噬菌體可提供更好的解決方案。其中，SILLANKORVA等[36]研究了噬菌體Phi S1的特定裂解噬菌體作為熒光假單胞菌生物被膜控制劑的功效。發(fā)現(xiàn)其可感染浮游細(xì)胞和生物被膜，導(dǎo)致2種情況下生物量降低約85%。研究表明，單裂解性噬菌體可通過(guò)解聚酶介導(dǎo)作用，顯著根除舊生物膜。應(yīng)用P100噬菌體對(duì)單增李斯特菌的特異性生物防治也非常有效，與對(duì)照組相比，噬菌體P100在第0天和第10天均能使單增李斯特菌數(shù)減少2.5個(gè)對(duì)數(shù)單位[37]。然而，目前仍需進(jìn)一步研究使用噬菌體來(lái)徹底根除病原體。噬菌體與抗生素聯(lián)用能使生物膜根除程度有所增強(qiáng)，其證實(shí)了噬菌體可增強(qiáng)抗生素功效的推測(cè)[38]。

(2)益生菌：益生菌為“活性微生物的給藥量足以為宿主帶來(lái)健康益處”[39]。其菌株可作為傳統(tǒng)化學(xué)滅菌劑的替代方式，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、排斥和置換，有效減少水產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌等病原菌生物被膜的形成。PETROVA等[40]研究發(fā)現(xiàn)益生菌菌株鼠李糖乳桿菌GG株的凝集素對(duì)各種病原體的生物被膜形成具有明顯的抑制作用，其還能破壞一些致病性病原體的成熟生物被膜。預(yù)防性使用益生菌，可提高養(yǎng)殖水生動(dòng)物的健康和畜牧性能，溶藻弧菌現(xiàn)已被用作許多厄瓜多爾蝦孵化場(chǎng)的益生菌，孵化時(shí)間從每月約7 d減少到每年約21 d，而生產(chǎn)量增加了35%[41]。

(3)酶：酶是對(duì)特定化學(xué)分子具有催化活性的蛋白質(zhì)，在食品加工過(guò)程中去除微生物生物被膜效果顯著。由于生物膜基質(zhì)中的異質(zhì)性，選擇恰當(dāng)?shù)拿柑幚矸绞胶苡斜匾褂脦追N不同酶的混合物能增加其對(duì)水產(chǎn)品中生物被膜的降解與消除[42]。相關(guān)學(xué)者在研究商業(yè)蛋白酶和淀粉酶對(duì)熒光假單胞菌形成的生物被膜的影響中發(fā)現(xiàn)，蛋白酶對(duì)熒光假單胞菌生物被膜EPS的降解效果較好，而淀粉酶的效果較差[43]。微生物生物被膜的去除和殺滅處理?xiàng)l件苛刻，其中以蛋白酶與多糖水解酶作用效果較好[44]。因此，根據(jù)安全無(wú)毒的特點(diǎn)，生物被膜的酶解控制技術(shù)可作為環(huán)保替代策略。

(4)群體感應(yīng)抑制劑：生物被膜中的微生物可通過(guò)信號(hào)分子進(jìn)行交流，并使用群體感應(yīng)優(yōu)化其毒力因子，提高其生存能力[45]。群體感應(yīng)被廣泛認(rèn)為是調(diào)節(jié)微生物中共同行為特定基因表達(dá)的有效機(jī)制[46]。前人研究發(fā)現(xiàn)，20 μg/mL北海苔蘚蟲(chóng)中的次生代謝產(chǎn)物溴化生物堿就可引起微生物生物被膜信號(hào)分子的強(qiáng)度降低，阻斷其生物被膜形成[47]。螺旋藻提取物等群體感應(yīng)抑制劑對(duì)生物被膜的抑制也具有良好效果，對(duì)水產(chǎn)品中希瓦氏菌形成的生物被膜抑制率達(dá)77.05%[48]。群體感應(yīng)可調(diào)節(jié)生物膜中微生物的基因表達(dá)，但使用群體感應(yīng)抑制劑解決上述問(wèn)題還有待深入研究。

3 前景與展望

與浮游微生物相比，微生物為適應(yīng)生存環(huán)境形成的生物被膜危害更大，抑制或消滅也更困難。水產(chǎn)品中的微生物生物被膜構(gòu)成了世界范圍內(nèi)的健康威脅，幾乎都可引起食源性疾病，嚴(yán)重程度從輕度腸胃炎到危及生命的感染，預(yù)防生物被膜形成比治療生物被膜更加有效。因此，需要進(jìn)一步研究用以解決水產(chǎn)品中生物被膜的抑制和消除問(wèn)題，最大限度減少水產(chǎn)品污染，提高其安全性。然而，目前還未僅使用一種方法可完全消除生物被膜而無(wú)副作用，仍須通過(guò)柵欄因子將多種處理方式優(yōu)化組合，發(fā)揮其協(xié)同作用，獲得更有效的處理效果。因此，研究人員需更好完善微生物生物被膜的控制技術(shù)，確保消費(fèi)者在水產(chǎn)品生產(chǎn)、加工、貯藏與食用等方面的安全。