郭鵬波 葛麗麗 鄭州兒童醫(yī)院兒科醫(yī)學研究所 （河南 鄭州 450018）

內(nèi)容提要： 目的：探索多重鏈接探針擴增技術（MLPA）檢測在杜氏肌營養(yǎng)不良檢測方面的應用價值。方法：對鄭州兒童醫(yī)院2018年3月～2018年8月收治的7例杜氏肌營養(yǎng)病例進行多重鏈接探針擴增技術（MLPA）+Sanger測序檢測。結(jié)果：隨機挑選7例DMD疑似病例及母親，通過多重鏈接探針擴增技術（MLPA）+Sanger測序檢測，7例為均陽性或攜帶者，4例患兒發(fā)病年齡為8月～8歲，其中3例患兒為運動障礙來醫(yī)院就診。結(jié)論：多重鏈接探針擴增技術（MLPA）檢測在杜氏肌營養(yǎng)不良檢測方面有重要應用價值，能檢測出大部分的患者，但是需要以Sanger測序方法作為補充。

假肥大性肌營養(yǎng)不良（DMD）又稱杜氏肌營養(yǎng)不良，位于X染色體短臂Xp21處的DMD基因發(fā)生缺失、重復或點突變導致[1]，發(fā)病率為1:3500[2]，初期病征3～7歲，像鴨子般搖搖擺擺的步態(tài)、腰椎前凸、經(jīng)常跌倒，從地板上站立和攀登樓梯時出現(xiàn)困難，跌倒時站立困難。隨著年齡增長，肌肉病變萎縮越來越嚴重。到12～13歲時，患者便需倚助輪椅出入?；颊叩男呐K肌肉也會因此病而引起變化，導致心肌病?？赡馨l(fā)生心律不正，心臟衰竭等病癥。通常到20多歲就會因為心肌、肺肌無力而死亡[3]。目前沒有治愈的方法，診斷DMD就變得尤為重要。本文介紹一種多重鏈接探針擴增技術（MLPA），可以診斷DMD，使用MLPA技術可以同時檢測DMD基因所有外顯子的缺失重復，約占病因的70～80%。

1. 實驗方法

取新鮮或兩周內(nèi)4攝氏度保存的EDTA抗凝全血，用QIAGEN試劑盒提取DNA，再用Nanodrop測量濃度，將DNA稀釋到20ng/μL，進行去下步驟的操作（荷蘭MRC公司MLPA試劑盒）：（1）取PCR反應管，各加入5μL DNA標本；（2）98?C變性5min，25?C冷卻；（3）配制探針MIX，往每個反應管內(nèi)加入3μL的探針MIX ；（4）95?C變性1min，60?C雜交過夜（16～20h）；（5）配制連接酶MIX，吹打混勻；PCR儀降至54?C，每個反應管加入32μL的連接酶MIX，54?C連接15min，98?C 5min滅活連接酶，反應體系降至20?C；（6）配制PCR MIX，吹打混勻；每個反應管加入10μL的PCR MIX；（7）進行35個PCR循環(huán)（95?C 30s—60?C 30s—72?C 1min）；72?C繼續(xù)延伸20min，15?C完成擴增；（8）配制毛細管電泳反應液MIX；取PCR管，每管加入9.2μL反應液MIX和0.7μL PCR產(chǎn)物；（9）86?C變性3min，4?C迅速冷卻；（10）上機。

本試驗使用ABI-3500基因分析儀，儀器設置：36cm毛細管：注射電壓：1.6 kV；注射時間：15秒；運行電壓:15 kV；多聚物：POP4；運行時間30分鐘。如果用POP7，運行電壓：10 kV；相應增加運行時間。密封注射混合物后，86?C變性3分鐘，4?C2min迅速冷卻。

2. 實驗對象

2018年3月～2018年8月來鄭州兒童醫(yī)院就診的疑似DMD患者：位**，位**之母，靳**，靳**之母，徐**，徐**之母，郭**。見表1。

郭**的MLPA檢測結(jié)果即非陽性又非陰性，如圖1。由于郭**的結(jié)果無法判讀，我們又采用Sanger測序方法對其進行測序，設計引物序列如表2。

檢測出郭**的序列后用Snapgene軟件與標準序列比對，發(fā)現(xiàn)郭**的DMD基因44號外顯子部分區(qū)域及上游內(nèi)含子缺失196個bp，為陽性病例。

表1. 結(jié)果

圖1. 6例DMD患兒及母親的MLPA結(jié)果

表2. 44號外顯子引物

3. 結(jié)果討論

多重連接探針擴增技術（MLPA）于2002年由Schouten等首先報道，是近幾年發(fā)展起來的一種針對待檢DNA序列進行定性和半定量分析的新技術。該技術高效、特異，在一次反應中可以檢測45個核苷酸序列拷貝數(shù)的改變，目前已經(jīng)應用于多個領域、多種疾病的研究。Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見DNA堿基序列的一種方法。

七位受檢者全部是陽性或攜帶者，這表明DMD不難診斷，有經(jīng)驗的臨床醫(yī)生基本可以通過觀察患者的臨床表型診斷。

郭**的MLPA結(jié)果出現(xiàn)0.4個拷貝是因為探針區(qū)域存在部分缺失，改變了模板的序列，影響了探針的結(jié)合。DMD是比較經(jīng)典的大片段基因缺失重復導致疾病，MLPA是檢測DMD的首選方法，陽性率達到70%～80%。微小缺失及重復占所有DMD患者的10%～20%。對于有明顯DMD臨床表型但MLPA結(jié)果陰性的患者建議進行測序分析。