王志紅， 王超， 彭銳

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065)

日本三角渦蟲Dugesiajaponica屬于扁形動(dòng)物門Platyhelminthes渦蟲綱Turbellaria，因其強(qiáng)大的再生能力成為研究再生的最佳模式生物之一(Rink，2013；Mangeletal.，2016)。對(duì)于任何類型的創(chuàng)傷，渦蟲幾乎都能夠完成修復(fù)和再生，被譽(yù)為是“切不死的動(dòng)物”(Tanetal.，2012)。渦蟲強(qiáng)大的再生能力源于其體內(nèi)成體干細(xì)胞的增殖與分化(Wagneretal.，2011；DeHaan & Ebert，2015)。渦蟲在再生過(guò)程中不僅有新組織的產(chǎn)生，創(chuàng)傷后剩余的舊組織(先存組織)還會(huì)通過(guò)細(xì)胞死亡和增殖的相互協(xié)調(diào)進(jìn)行身體重塑，以適應(yīng)身體的比例(Baguá & Romero，1981)，因此，在渦蟲再生過(guò)程中，細(xì)胞凋亡可能起到了重要的作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種形式，用來(lái)消除機(jī)體中不需要的細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)組織內(nèi)的平衡(Jangetal.，2007)。細(xì)胞凋亡主要由Caspase介導(dǎo)。Caspase是一種在多細(xì)胞生物中高度保守的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，其功能已被廣泛研究(郭素英等，2009)，但是Caspase家族在渦蟲中的研究還很少。有學(xué)者從渦蟲cDNA文庫(kù)中鑒定出了Caspase-likegene 1、2、3，分別命名為Djclg-1、Djclg-2、Djclg-3，并發(fā)現(xiàn)只有Djclg-3基因的表達(dá)量較高，而Djclg-3基因在控制渦蟲體細(xì)胞數(shù)量、消除不必要的組織或者細(xì)胞，以及在組織器官重塑過(guò)程中起到了重要作用，這是第一次對(duì)渦蟲凋亡相關(guān)基因的報(bào)道(Hwangetal.，2004)。Caspase-7與Caspase-3同為Caspase家族中細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行者，執(zhí)行蛋白質(zhì)水解的協(xié)調(diào)程序，并且在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用(Thomsenetal.，2013)，除了參與細(xì)胞的調(diào)控外，還參與非凋亡活動(dòng)的調(diào)控，如調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化等(Parketal.，2018)，但在渦蟲體內(nèi)的作用還未見報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

日本三角渦蟲由清華大學(xué)吳畏教授實(shí)驗(yàn)室提供。室溫下以飲用水飼養(yǎng)，每天換水1次，并隔1天喂食豬肝1次。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

本實(shí)驗(yàn)中所用rTaq DNA聚合酶、RNAiso、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購(gòu)于TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)Master Mix購(gòu)于Innovagene公司；引物合成及測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1Caspase-7基因的克隆根據(jù)SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit說(shuō)明書制備cDNA模板，利用SMART通用引物和Caspase-7-RACE-F1/R1引物(表1)進(jìn)行巢式PCR第一輪擴(kuò)增。然后利用巢式PCR通用引物和Caspase-7-RACE-F2/R2引物(表1)進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并切膠回收與預(yù)期片段大小一致的條帶，將測(cè)序結(jié)果拼接，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果比對(duì)。

1.3.2Caspase-7基因全長(zhǎng)拼接及序列分析利用MEGA 6對(duì)5’-RACE和3’-RACE結(jié)果進(jìn)行拼接；利用DNAMAN將核苷酸序列翻譯為氨基酸后，與其他19個(gè)物種(表2)的Caspase-7氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；利用SWISS-MODEL網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)渦蟲Caspase-7蛋白三維結(jié)構(gòu)；最后利用MEGA 6中的鄰接法進(jìn)行Caspase-7系統(tǒng)發(fā)育樹的重建，選擇氨基酸取代模型，并采用自舉檢驗(yàn)法(bootstrap test，重抽樣1 000次)評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹中各節(jié)點(diǎn)的置信度。

表2 19個(gè)物種Caspase-7的GenBank登錄號(hào)Table 2 GenBank accession number of Caspase-7 sequences from 19 species

1.3.3qPCR檢測(cè)渦蟲切后再生不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-7基因的表達(dá)量分別提取切后再生0 h、6 h 和1～3 d渦蟲的RNA，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，通過(guò)qPCR方法檢測(cè)Caspase-7基因在不同時(shí)間段的表達(dá)量，引物序列參見表1。以0 h為對(duì)照，β-actin為內(nèi)參。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。qPCR體系：2×qPCR Master mix 5 μL，cDNA 0.5 μL，Caspase-7-qPCR正、反向引物各0.3 μL，ddH2O 3.9 μL。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃退火并延伸60 s，39個(gè)循環(huán)。結(jié)果按2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析并繪圖。

1.3.4Caspase-7dsRNA體外轉(zhuǎn)錄及干擾用2對(duì)帶有T7啟動(dòng)子的Caspase-7 PCR引物(表1)從渦蟲cDNA中擴(kuò)增得到Caspase-7不同區(qū)域的DNA，并以此為模板，利用T7 RNA聚合酶在37 ℃體外轉(zhuǎn)錄獲得干擾用的2條Caspase-7 dsRNA。選取40條長(zhǎng)度約1 cm的渦蟲，平均分為2組。一組將制備好的2條Caspase-7 dsRNA與渦蟲食物混合，然后喂食渦蟲，以干擾渦蟲體內(nèi)Caspase-7基因的表達(dá)，作為Caspase-7干擾組；另一組將DEPC水與渦蟲食物混合并喂食渦蟲，作為對(duì)照組。Caspase-7干擾組與對(duì)照組都隔1天喂食1次，共喂6次，具體方法參見Rouhana等(2013)。

1.3.5Caspase-7干擾效率檢測(cè)及干擾后表型觀察

在對(duì)渦蟲進(jìn)行第6次喂食dsRNA后的第4天，渦蟲體內(nèi)dsRNA被消化后(Rouhanaetal.，2013)，分別提取對(duì)照組和Caspase-7干擾組的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Caspase-7 qPCR引物檢測(cè)各組Caspase-7基因的表達(dá)量。另外，在第6次喂食后的第3天，將渦蟲分為2組：一組于渦蟲咽前部位進(jìn)行切割，另一組不切割，然后每天觀察并拍照記錄渦蟲形態(tài)變化。2組渦蟲在觀察表型的過(guò)程中均不喂食。

1.3.6Caspase-7干擾后Djclg-3及PCNA基因表達(dá)變化檢測(cè)Caspase-7干擾組與對(duì)照組渦蟲在不切割直接饑餓7 d后，提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別利用Djclg-3基因、PCNA基因和β-actinqPCR引物(表1)，通過(guò)qPCR技術(shù)檢測(cè)Djclg-3基因與PCNA基因的表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。結(jié)果按2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析并繪圖。

投資活動(dòng)現(xiàn)金流的使用需要考慮到多種因素，既需要對(duì)投資的盈利性、回報(bào)時(shí)間等方面進(jìn)行考慮，還需要對(duì)資金流總量的合理性進(jìn)行分析，以此確保現(xiàn)金流管理能夠有效發(fā)揮作用。

2 結(jié)果

2.1 Caspase-7基因全長(zhǎng)克隆及序列分析

對(duì)5’-RACE結(jié)果中約250 bp的片段(圖1：a中箭頭所指)和3’-RACE結(jié)果中約770 bp的片段(圖1：b中箭頭所指)進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收并測(cè)序驗(yàn)證，將5’-RACE和3’-RACE所得序列進(jìn)行拼接，得到渦蟲Caspase-7基因全長(zhǎng)(圖2；GenBank登錄號(hào)：MH256116)。該基因全長(zhǎng)935 bp，編碼251個(gè)氨基酸，5’-UTR區(qū)長(zhǎng)86 bp，3’-UTR區(qū)長(zhǎng)93 bp。

為進(jìn)一步確認(rèn)所得序列為渦蟲Caspase-7基因序列，將克隆得到的日本三角渦蟲Caspase-7氨基酸序列與其他19個(gè)物種進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Caspase家族中2大保守而關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域LSHG和QAC-(Q/R)G(Hwangetal.，2004)也存在于渦蟲Caspase-7基因(圖3)中。在這2大結(jié)構(gòu)域中，組氨酸和半胱氨酸是催化活性中心的重要?dú)埢?/p>

圖1 渦蟲Caspase-7基因RACE擴(kuò)增結(jié)果
Fig. 1 RACE amplification of planarianCaspase-7 gene

a. 5’-RACE， b. 3’-RACE， 1～4. 4個(gè)重復(fù)組， Marker. DL2000

a. 5’-RACE， b. 3’-RACE， 1-4. 4 replicates， Marker. DL2000

圖2 渦蟲Caspase-7基因全長(zhǎng)序列Fig. 2 The complete sequence of planarian Caspase-7 gene

編碼序列上方為Caspase-7基因結(jié)構(gòu)示意圖(共935 bp)， 其中， 左右兩端白色區(qū)域分別代表5’-UTR(86 bp)和3’-UTR(93 bp)區(qū)， 中間陰影部分表示編碼區(qū)(CDS， 756 bp)， CDS區(qū)兩端黑色和灰色部分分別代表ATG起始密碼子和TAA終止密碼子； 堿基序列下方為每個(gè)密碼子編碼的氨基酸， *終止密碼子

Upper： a schematic representation of the planarianCaspase-7 gene (935 bp in total)， the white regions at the ends of 2 sides represent the 5’-UTR (left， 86 bp) and 3’-UTR (right， 93 bp) regions， respectively， the middle shadow region indicates the coding sequence (CDS， 756 bp)， the black and gray portions at both ends of the CDS region represent the ATG start codon and the TAA stop codon， respectively； lower： the complete sequence of planarianCaspase-7 mRNA， amino acids encoded by each codon are shown under the nucleotide sequences， and * represents the stop codon

圖3 渦蟲Caspase-7與其他物種同源比對(duì)部分結(jié)果Fig. 3 Homology comparison of planarian Caspase-7 and other species

a. Caspase-7的結(jié)構(gòu)特征， b. 同源序列比對(duì)； 黑色框線和灰色框線為Caspase家族2個(gè)保守的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域

a. structural characteristics of the Caspase-7， b. homologous sequence alignment； the 2 key domains conserved in the Caspase family are shown in the black frame and gray frame， respectively

2.2 Caspase-7蛋白酶三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

根據(jù)克隆所得的渦蟲Caspase-7氨基酸序列預(yù)測(cè)得到了其三維結(jié)構(gòu)(圖4)，其中包含2個(gè)催化單位，每個(gè)催化單位都具有5個(gè)α螺旋和6個(gè)β折疊；渦蟲Caspase-7的潛在催化位點(diǎn)由4個(gè)表面環(huán)(L1～L4)構(gòu)成；另外，渦蟲Caspase-7蛋白酶活性中心的關(guān)鍵殘基——半胱氨酸殘基(圖4：黑色三角形所指)位于L2環(huán)上。

2.3 Caspase-7基因的進(jìn)化分析

進(jìn)化樹顯示，渦蟲Caspase-7基因和同為扁形動(dòng)物門的曼氏血吸蟲Schistosomamansoni及埃及血吸蟲S.haematobium沒(méi)有較近的親緣關(guān)系，而與刺胞動(dòng)物門Cnidaria水螅Hydravulgaris有最近的親緣關(guān)系(圖5)，說(shuō)明不同物種之間Caspase-7基因可能發(fā)生了趨同進(jìn)化。

2.4 渦蟲再生不同時(shí)間段Caspase-7表達(dá)量變化

為分析Caspase-7基因是否參與渦蟲細(xì)胞凋亡調(diào)控，通過(guò)qPCR檢測(cè)渦蟲切后再生不同時(shí)間段Caspase-7基因的表達(dá)量變化(圖6)。Caspase-7基因在渦蟲切后再生6 h輕微升高，在渦蟲切后再生3 d升高明顯(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)變化不明顯。

圖4 渦蟲Caspase-7蛋白三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig. 4 Predicted three-dimensional structure of planarian Caspase-7 protein

α1～α5(α1’～α5’)分別代表5個(gè)α螺旋； L1～L4(L1’～L4’)分別代表4個(gè)表面環(huán)； 2個(gè)黑色三角形所指為半胱氨酸殘基所在位點(diǎn)

α1-α5 (α1’-α5’) represent 5 alpha helices， respectively； L1-L4 (L1’-L4’) represent 4 surface loops， respectively； two black triangles point to the cysteine site， key amino acid residue in active center

圖5 渦蟲與其他物種Caspase-7基因進(jìn)化樹
Fig. 5 Phylogenetic analysis ofCaspase-7 gene between planarian and other species

圖6 渦蟲切后再生不同時(shí)間段Caspase-7基因表達(dá)量變化Fig. 6 The expression changes of Caspase-7 gene at different times during planarian regeneration

*P<0.05

2.5 干擾Caspase-7基因影響渦蟲組織重塑

為了進(jìn)一步分析Caspase-7基因在渦蟲中的作用，通過(guò)喂食Caspase-7 dsRNA干擾渦蟲體內(nèi)Caspase-7基因的表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示，喂食Caspase-7 dsRNA能成功干擾渦蟲體內(nèi)的Caspase-7基因的表達(dá)(圖7：a，P<0.01)。Caspase-7干擾組渦蟲切后的頭部片段(5/5)和尾部片段(5/5)均能完成再生，說(shuō)明干擾Caspase-7并不影響渦蟲的再生。但在Caspase-7干擾組渦蟲切后的第11天，其頭部及尾部發(fā)生溶解(5/5)(圖7：d)，而此時(shí)對(duì)照組渦蟲形態(tài)仍然正常(5/5)。此外，Caspase-7干擾組未切割渦蟲在饑餓7 d后(圖7：c)，頭部和尾部也發(fā)生部分溶解(5/5)，而對(duì)照組正常(5/5)。這說(shuō)明干擾Caspase-7的表達(dá)對(duì)饑餓環(huán)境下的成體渦蟲(再生完成后的或未切割的成蟲)會(huì)造成明顯的影響，導(dǎo)致蟲體發(fā)生溶解。

2.6 Caspase-7干擾后Djclg-3與PCNA基因表達(dá)變化

Caspase-7干擾組渦蟲在饑餓環(huán)境下發(fā)生溶解時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡的另一關(guān)鍵基因Djclg-3以及增殖相關(guān)基因PCNA的表達(dá)變化。qPCR結(jié)果顯示，成體渦蟲饑餓處理7 d后，Djclg-3和PCNA基因的表達(dá)量相較于對(duì)照組顯著降低(P<0.001)，即細(xì)胞凋亡與增殖大幅度減少(圖8)。

3 討論

Caspase-7是Caspase家族的重要成員之一，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著促凋亡作用。未激活的Caspase-7以酶原的形式存在，一旦被上游分子剪切激活后，活化的Caspase-7可以對(duì)其底物進(jìn)行切割，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生(Hilletal.，2016)。細(xì)胞凋亡的缺失會(huì)導(dǎo)致多種癌癥的發(fā)生(Puttetal.，2006；Wolanetal.，2009；Thomsenetal.，2013)。此外，Caspase-7還在炎癥反應(yīng)、神經(jīng)激活和細(xì)胞分化中起著重要的作用(Martinon & Tschopp，2007；Kuranaga，2012)。Caspase-7不僅參與凋亡的調(diào)控，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及分化等(Chaudharyetal.，2016；Leietal.，2017；Parketal.，2018)。

圖7 干擾Caspase-7對(duì)渦蟲的影響Fig. 7 Effect of Caspase-7 interference on planarian growth

a.Caspase-7干擾檢測(cè)結(jié)果， b. 渦蟲于咽前切后再生頭部第6天的表型， c. 未切割渦蟲饑餓第7天的表型， d. 渦蟲于咽前切后再生頭部第11天的表型；**P<0.01

a. theCaspase-7 interference efficiency， b. the regenerative planarian heads after 6 days of amputation， c. the planarians after starvation for 7 days， d. the regenerative planarian heads after 11 days of amputation；**P<0.01

圖8 Caspase-7干擾后各基因表達(dá)變化Fig. 8 Gene expression changes after Caspase-7 interference

***P<0.001

本研究發(fā)現(xiàn)，在渦蟲切后再生6 h和3 d，Caspase-7基因表達(dá)量升高，這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)是渦蟲切后凋亡發(fā)生的2個(gè)高峰期(Hwangetal.，2004)，這表明Caspase-7可能在渦蟲中參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，干擾Caspase-7基因后，渦蟲再生沒(méi)有受到影響，但再生完成后或未切割的成體渦蟲在饑餓環(huán)境下，Caspase-7干擾組蟲體會(huì)逐漸溶解直至死亡。其發(fā)生溶解時(shí)，Djclg-3與PCNA基因表達(dá)量顯著降低。

細(xì)胞凋亡在渦蟲組織重塑的過(guò)程中起著重要的作用(Pellettierietal.，2010)。Caspase-3是Caspase家族中另一重要的凋亡執(zhí)行者(Chaietal.，2001；Jangetal.，2007)，可以被Caspase家族中凋亡起始者Caspase-8和Caspase-9所剪切，活化的Caspase-3可以降解多種細(xì)胞蛋白，并在細(xì)胞凋亡過(guò)程中負(fù)責(zé)細(xì)胞形態(tài)的改變和DNA的斷裂，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和組織器官的尺寸(Liuetal.，2017；Yosefzonetal.，2018)。已有研究表明，Djclg-3基因在渦蟲再生過(guò)程中參與渦蟲細(xì)胞數(shù)量的控制，對(duì)組織重塑過(guò)程有調(diào)控作用(Hwangetal.，2004)。在饑餓環(huán)境下，渦蟲沒(méi)有外在能量的供應(yīng)，只能靠自身細(xì)胞的死亡來(lái)提供生存所需的能量和物質(zhì)，因此渦蟲會(huì)發(fā)生退行性生長(zhǎng)，即渦蟲軀體會(huì)不斷縮小。此時(shí)，渦蟲組織和器官會(huì)通過(guò)細(xì)胞死亡和增殖的協(xié)調(diào)而重塑，以適應(yīng)不斷縮小的身體比例(Mead & Christman，1998；Weissman，2000)。受Caspase-7基因干擾后，Djclg-3與PCNA基因的表達(dá)量顯著降低，可能導(dǎo)致饑餓環(huán)境下渦蟲的細(xì)胞凋亡與增殖減少，渦蟲組織重塑難以完成，以至于蟲體不斷溶解并最終死亡。該結(jié)果說(shuō)明，Caspase-7可能在渦蟲的組織重塑中發(fā)揮著重要作用。

本文首次報(bào)道渦蟲中Caspase-7基因全長(zhǎng)并分析了其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，檢測(cè)了渦蟲再生不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量變化，并對(duì)Caspase-7在渦蟲中的功能進(jìn)行了初步探索，為渦蟲細(xì)胞凋亡的研究及細(xì)胞凋亡與再生關(guān)系的探索奠定了基礎(chǔ)。