王小玲, 馬 琨, 汪志琴, 李 越, 魏?；?/p>

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冬小麥免耕覆蓋與有機(jī)栽培對(duì)土壤微生物群落組成的影響*

王小玲1,2, 馬 琨1**, 汪志琴1,2, 李 越2, 魏?；?

(1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川 750021; 2. 寧夏大學(xué)西北土地退化與生態(tài)恢復(fù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 銀川 750021)

為揭示農(nóng)業(yè)管理活動(dòng)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及AM真菌多樣性的影響, 以農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)為研究對(duì)象, 選取免耕覆蓋+施有機(jī)肥(NF)、免耕覆蓋+不施有機(jī)肥(NC)、傳統(tǒng)耕作不覆蓋+施有機(jī)肥(TF)和傳統(tǒng)耕作不覆蓋+不施有機(jī)肥(TC)4種處理, 采用Illumina Miseq高通量測(cè)序及磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acids, PLFAs)分析方法, 研究持續(xù)冬小麥免耕覆蓋有機(jī)栽培3年后, 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成、AM真菌及其多樣性與土壤環(huán)境因子間的關(guān)系。結(jié)果表明, 持續(xù)免耕覆蓋有機(jī)栽培能增加以PLFA表征的土壤微生物群落的生物量, 傳統(tǒng)耕作顯著提高了土壤革蘭氏陽性菌(G+)、陰性菌(G-)的生物量(<0.05)。且隨免耕栽培管理年限增加, 土壤AM真菌生物量呈顯著上升趨勢(shì); 以16:1ω5c中性脂(NLFA)與16:1ω5c磷脂(PLFA)表征的AM真菌生物量比值顯著升高(<0.05)。免耕覆蓋措施下, 有機(jī)肥的施用提高了土壤AM真菌豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)), 但降低了土壤AM真菌的多樣性(香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù))。主成分分析結(jié)果顯示, AM真菌孢子(16:1ω5c中性脂)的生物量與土壤有機(jī)質(zhì)、土壤易提取球囊霉素含量呈正相關(guān)關(guān)系, AM真菌豐富度指數(shù)與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān), AM真菌多樣性指數(shù)與土壤全氮含量、脲酶活性呈正相關(guān)。受農(nóng)業(yè)管理措施導(dǎo)致的土壤理化性狀及土壤生物學(xué)差異等綜合因素影響, 土壤微生物生物量及AM真菌多樣性和豐富度改變。免耕覆蓋措施提高了土壤AM真菌多樣性指數(shù), 有機(jī)肥施用顯著影響了AM真菌NLFA/PLFA生物量的比例, 改變了AM真菌孢子和菌絲間生物量碳的分配關(guān)系。

免耕覆蓋; 有機(jī)栽培; 冬小麥; 微生物群落; AM真菌; 環(huán)境因子

免耕是近幾十年來農(nóng)田管理中的一種保護(hù)性措施, 相比傳統(tǒng)耕作, 免耕可增加土壤表面的殘茬覆蓋, 減少地表徑流、增加土壤表層有機(jī)質(zhì)含量[1]; 同時(shí), 免耕通過減少土壤機(jī)械擾動(dòng), 有利于減少土壤壓實(shí), 保持良好的土壤孔隙度, 從而改善微生物群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性, 優(yōu)化土壤環(huán)境, 間接影響作物養(yǎng)分吸收情況以及作物產(chǎn)量。此外, 土壤微生物不僅驅(qū)動(dòng)土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化和養(yǎng)分循環(huán), 還可作為土壤中植物有效養(yǎng)分的儲(chǔ)備庫(kù)[2]。作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 近年來對(duì)不同耕作措施下土壤微生物生物量及微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究越來越受到人們的重視。相關(guān)研究表明, 長(zhǎng)期免耕或綠肥翻壓可以增加表層土壤微生物數(shù)量[3], 對(duì)土壤微生物多樣性也會(huì)產(chǎn)生顯著影響[4-5]。31年長(zhǎng)期施肥研究表明, 有機(jī)肥施入能提高土壤革蘭氏陽性菌(G+)、陰性菌(G-)的比值(G+/G-)、細(xì)菌/真菌的比值, 細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)組成也受到土壤有機(jī)碳和土壤碳氮比(C/N)的影響[6]。隨農(nóng)田秸稈還田量增加, 土壤真菌群落數(shù)量和多樣性指數(shù)顯著增加; 土壤有機(jī)碳、pH和速效磷是導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化的主要因素[7]。

叢枝菌根真菌(fungi, AMF)是一種在自然生態(tài)系統(tǒng)與農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的真菌, 能夠與植物根系產(chǎn)生互利共生的土壤微生物[8]?？捎行岣咧参飳?duì)氮、磷等養(yǎng)分的獲取能力[9]、提高植物的抗旱性以及維持植物群落的多樣性[10]; 而且AM真菌在促進(jìn)地上部碳源向地下分配, 提高土壤有機(jī)碳含量, 改善土壤結(jié)構(gòu), 增強(qiáng)土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性方面扮演著重要角色[11]。張貴云等[12]經(jīng)過22年長(zhǎng)期保護(hù)性耕作試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 免耕覆蓋處理AM真菌多樣性最高, 傳統(tǒng)耕作處理最低。免耕可以增加AM真菌群落豐度, 促進(jìn)侵染率, 提高AM真菌產(chǎn)孢量, 進(jìn)而提高作物產(chǎn)量[13]。而傳統(tǒng)耕作則在一定程度上影響了AM真菌生物量, 導(dǎo)致菌絲體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞[14]。

雖然有關(guān)土壤AM真菌的研究有許多報(bào)道, 但是由于氣候條件、土壤類型以及耕作制度的復(fù)雜性, 有關(guān)保護(hù)性耕作措施對(duì)AM真菌的影響, 仍然缺乏?；诖? 本試驗(yàn)采用磷脂脂肪酸(PLFA)和Illumina MiSeq高通量測(cè)序手段, 研究免耕覆蓋有機(jī)栽培下土壤AM真菌在土壤微生物群落組成中的分布特征, 探討了不同管理措施和土壤因子對(duì)土壤微生物群落、AM真菌組成及其多樣性的影響,旨在揭示AM真菌是如何在短時(shí)間內(nèi)響應(yīng)農(nóng)業(yè)綜合管理活動(dòng)帶來的影響, 農(nóng)業(yè)綜合管理活動(dòng)是否會(huì)通過影響AM真菌菌絲和孢子生物量來影響碳的分配, 以期為寧夏南部山區(qū)長(zhǎng)期免耕覆蓋栽培技術(shù)的推廣以及農(nóng)田土地可持續(xù)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地點(diǎn)位于寧夏固原市隆德縣沙塘鎮(zhèn)和平村(35°12′36″N, 105°28′48″E), 海拔1 883 m, 年均降水量410 mm, 年均蒸發(fā)量1 370 mm, 年有效積溫為2 400 ℃, 年均氣溫6 ℃。土壤類型為黑壚土, 母質(zhì)為黃土。試驗(yàn)前土壤基本理化性狀為: pH 9.0, 全氮0.52 g×kg-1, 有機(jī)質(zhì)10.63 g·kg-1, 堿解氮41.0 mg×kg-1, 全磷0.65 g×kg-1, 速效磷45.5 mg×kg-1, 速效鉀170.5 mg×kg-1

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開始于2015年4月, 采用雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 4個(gè)處理, 4次重復(fù), 小區(qū)面積3 m×4 m。其中A因素為耕作覆蓋: 免耕覆蓋(N)、傳統(tǒng)耕作不覆蓋(T); B因素為施肥: 施用有機(jī)肥(F)和不施有機(jī)肥(C)。4個(gè)處理分別為: 免耕覆蓋+施有機(jī)肥(NF)、免耕覆蓋+不施有機(jī)肥(NC)、傳統(tǒng)耕作不覆蓋+施有機(jī)肥(TF)和傳統(tǒng)耕作不覆蓋+不施有機(jī)肥(TC)。2015年春季整地, 第1茬作物為蠶豆(L.), 供試品種為‘臨蠶6號(hào)’, 當(dāng)年4月20日播種, 7月底收獲。2015年、2016年、2017年9月按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別種植冬小麥(L.), 供試品種為‘藍(lán)天32號(hào)’。2015年冬小麥種植前將3 000 kg×hm-2的蠶豆秸稈粉碎與3 000 kg?hm-2的小麥脫粒后的穎殼混合后均勻覆蓋于免耕處理土壤表面, 其后不再覆蓋。冬小麥播種量為375 kg?hm-2, 每小區(qū)12行, 每行播31.25 kg?hm-2, 施肥處理中生物有機(jī)肥(黃腐酸≥12%, 有機(jī)質(zhì)≥40%, 巨大芽孢桿菌+膠凍樣類芽孢桿菌≥0.5億×g-1, 凈含量40 kg×袋-1)施用量每小區(qū)折合純氮(N)90 kg?hm-2、磷(P2O5)19.7 kg?hm-2、鉀(K2O%)18.6 kg?hm-2。免耕處理冬小麥播種前將生物有機(jī)肥均勻撒施于地表, 傳統(tǒng)耕作處理的生物有機(jī)肥隨耕翻進(jìn)入土壤。免耕覆蓋處理試驗(yàn)期間均不進(jìn)行任何耕翻擾動(dòng), 傳統(tǒng)耕作在冬小麥?zhǔn)斋@后及種植前正常耕翻。免耕處理田間雜草齊地表剪掉, 雜草覆蓋在作物行間; 傳統(tǒng)耕作處理田間雜草連根拔除, 扔出田外。

1.3 樣品采集

土壤樣品分別采集于2015年、2016年和2017年冬小麥開始種植及收獲前, 利用“五點(diǎn)取樣法”, 從0~20 cm土層采集冬小麥行間土壤樣本, 各小區(qū)土壤樣本獨(dú)立, 低溫儲(chǔ)存帶回實(shí)驗(yàn)室, 過1 mm篩, 部分儲(chǔ)存在-40 ℃冰箱用于土壤主要微生物類群的PLFA測(cè)定, 部分儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱用于土壤AM真菌多樣性的測(cè)定, 其余樣品自然風(fēng)干, 用于土壤理化性狀測(cè)定。

1.4 研究方法

1.4.1 土壤基本理化性狀分析

土壤全氮、全磷、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀的測(cè)定分別采用半微量凱氏法、硫酸-高氯酸消煮-鉬銻抗比色法、重鉻酸鉀容量法、堿解擴(kuò)散法、Olsen法和NH4OAc浸提-火焰光度法, pH測(cè)定的水土比為5∶1[15]。

1.4.2 土壤微生物主要類群磷脂脂肪酸的測(cè)定

利用PLFAs分析來研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成。稱取相當(dāng)于5 g干土重的新鮮土樣, 按照魏?；鄣萚16]的提取步驟: 在進(jìn)樣口為250 ℃、He流量為40 mL×min-1(0.4 MPa)、氮?dú)?0.4 Mpa)、色譜柱為Agilent HP-5MS, 30 μm×250 μm×0.25 μm, 柱溫: 170 ℃。利用中國(guó)科學(xué)院青藏高原研究所高寒生態(tài)研究室的Agilent 6850型氣相色譜儀測(cè)定, MIDI Sherlock脂肪酸圖譜微生物鑒定系統(tǒng)分析待檢樣品。

1.4.3 土壤DNA提取和PCR擴(kuò)增

土壤DNA樣品的提取采用AXYGEN公司生產(chǎn)的試劑盒。按照說明書步驟進(jìn)行提取, 選擇AMV4.5NF/AMDGR作為引物[17], 正向引物序列為: 5￠-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3￠, 反向引物序列5￠-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3￠, 在引物上添加6個(gè)bp的樣本特異性Barcode序列, 進(jìn)而對(duì)特定基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 測(cè)序及數(shù)據(jù)質(zhì)量控制等均由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析及處理

對(duì)下機(jī)原始數(shù)據(jù)去除引物接頭序列和各低質(zhì)量堿基(phred Quality Score≤20)后進(jìn)行拼接, 舍棄長(zhǎng)度小于150 bp的序列, 且不允許存在模糊堿基(ambiguous base)N, 并去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體后[18], 得到有效序列608 752條。使用QIIME(quantitative insights into microbial ecology, v1.8.0)軟件, 調(diào)用UCLUST序列比對(duì)工具, 對(duì)根據(jù)質(zhì)量控制篩選出的優(yōu)質(zhì)序列按97%相似度水平的操作分類單元OTU (operational taxonomic units)代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析, 構(gòu)建OTU時(shí)選取代表性序列(出現(xiàn)頻率最高的序列)得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類學(xué)信息, 隨后, 基于物種分類分析結(jié)果, 使用QIIME 1.8軟件對(duì)樣品的Alpha多樣性進(jìn)行分析, 計(jì)算AM真菌的Simpson、Shannon、Chao1和ACE多樣性指數(shù)。

利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理, DPS 7.05進(jìn)行方差分析和Turkey多重比較。采用Canoco 5.0軟件分析影響土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)及AM真菌多樣性的主要土壤理化、生物學(xué)性狀的環(huán)境因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬小麥免耕覆蓋與施有機(jī)肥對(duì)土壤主要微生物類群的影響

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 其種群結(jié)構(gòu)變化在一定程度上能夠調(diào)節(jié)土壤肥力狀況及養(yǎng)分供應(yīng)能力[19]。由表1可見, 隨冬小麥免耕種植年限的延長(zhǎng), 土壤主要微生物類群結(jié)構(gòu)組成有不同的變化。與試驗(yàn)開始前(2015年)相比, 連續(xù)處理2年后(2017年), 免耕覆蓋不施有機(jī)肥(NC)處理中, 土壤細(xì)菌及G+的生物量顯著增加, 而真菌、G-、真菌與細(xì)菌比例略有降低。在免耕覆蓋施有機(jī)肥處理(NF)中, 土壤細(xì)菌、真菌、放線菌、真菌/細(xì)菌生物量的比值均顯著低于試驗(yàn)初期; 而傳統(tǒng)耕作不覆蓋不施有機(jī)肥(TC)中, 細(xì)菌、G+和G+/G-生物量的比值均呈現(xiàn)增加趨勢(shì), 但差異不顯著; 傳統(tǒng)耕作不覆蓋施有機(jī)肥(TF)中, 土壤細(xì)菌生物量較試驗(yàn)初期增加了25.12%, 而真菌和放線菌則呈穩(wěn)定降低趨勢(shì), 分別降低了24.39%、0.23%。這可能是由于連續(xù)免耕覆蓋、有機(jī)種植冬小麥后改善了土壤的水熱狀況, 從而影響了土壤微生態(tài)環(huán)境條件?？傮w上, 隨栽培年限的延長(zhǎng), 土壤細(xì)菌生物量有增加的趨勢(shì), 放線菌在年際間的不同處理中無明顯變化規(guī)律, 而真菌生物量整體呈顯著降低的趨勢(shì)。

免耕覆蓋管理2年后, 有機(jī)肥管理下以特征脂肪酸表征的土壤細(xì)菌、放線菌生物量表現(xiàn)為NC>NF, 真菌則呈相反趨勢(shì)。TF處理的土壤細(xì)菌、真菌、放線菌、真菌/細(xì)菌、G+及G-均高于TC處理。TF條件下, 有機(jī)肥的施用導(dǎo)致土壤G-差異顯著, 比TC處理提高了20.83%; 不施有機(jī)肥情況下, 土壤細(xì)菌和放線菌生物量的差異雖不顯著, 但卻呈截然相反趨勢(shì), 細(xì)菌表現(xiàn)為TC>NC, 放線菌表現(xiàn)為TCNF。整體而言, 試驗(yàn)初期, 土壤主要微生物類群的生物量無顯著性差異, 而連續(xù)免耕覆蓋、有機(jī)栽培2年后則出現(xiàn)顯著性差異。

表1 連續(xù)免耕覆蓋與有機(jī)栽培對(duì)土壤主要微生物類群的影響

不同小寫字母代表不同處理間差異在0.05水平上顯著。NC: 免耕覆蓋不施有機(jī)肥; NF: 免耕覆蓋施有機(jī)肥; TC: 傳統(tǒng)耕作不覆蓋不施有機(jī)肥; TF: 傳統(tǒng)耕作不覆蓋施有機(jī)肥。Different lowercase letters indicate significant differences among treatments at 0.05 level. NC: no-tillage and straw mulching without organic fertilizer application; NF: no-tillage and straw mulching with organic fertilizer application; TC: traditional tillage and no-mulching without organic fertilizer application; TF: traditional tillage and no-mulching with organic fertilizer application.

2.2 冬小麥免耕覆蓋與有機(jī)栽培對(duì)土壤AM真菌結(jié)構(gòu)組成的影響

由表2可見, 試驗(yàn)初期土壤AM真菌生物量、AM真菌占土壤微生物總PLFA生物量的比值在各處理間無明顯差異, 但不施有機(jī)肥處理中16:1ω5c中性脂(NLFA)/PLFA的比例均高于施有機(jī)肥處理, 表現(xiàn)為TC>TF、NC>NF。連續(xù)免耕覆蓋與有機(jī)栽培2年后(2017年), AM真菌占總PLFA生物量的比值無顯著性差異, NC及TC處理中, 有機(jī)肥的施用并沒有影響土壤中AM真菌磷脂(菌絲體結(jié)構(gòu)脂)生物量; NC與NF, TF與TC之間AM真菌菌絲體的生物量間無明顯差異, 而AM真菌中性脂(孢子貯存脂)生物量卻表現(xiàn)為NC>NF、TF>TC。這說明免耕覆蓋無肥、傳統(tǒng)耕作施有機(jī)肥結(jié)合更有利于土壤AM真菌孢子的繁殖, 能增加以貯存脂形態(tài)存在的AM真菌孢子生物量碳的比例。土壤AM真菌總生物量也表現(xiàn)出和AM真菌中性脂相似的趨勢(shì); 與NC相比, NF處理以特征脂肪酸表征的AM真菌總生物量顯著降低48.71%。在NF管理措施下, AM真菌中性脂(孢子貯存脂)和磷脂(菌絲體結(jié)構(gòu)脂)生物量的比值也表現(xiàn)出顯著差異(<0.05)。說明免耕覆蓋、不施有機(jī)肥及傳統(tǒng)耕作施有機(jī)肥的交互作用, 能改變土壤中AM真菌菌絲體及孢子中生物量碳的分配比例關(guān)系。

表2 連續(xù)免耕覆蓋有機(jī)管理對(duì)土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響

不同小寫字母代表不同處理間差異在0.05水平上顯著。NC: 免耕覆蓋不施有機(jī)肥; NF: 免耕覆蓋施有機(jī)肥; TC: 傳統(tǒng)耕作不覆蓋不施有機(jī)肥; TF: 傳統(tǒng)耕作不覆蓋施有機(jī)肥。Different lowercase letters indicate significant differences among treatments at 0.05 level. NLFA: neutral lipid acid. NC: no-tillage and straw mulching without organic fertilizer application; NF: no-tillage and straw mulching with organic fertilizer application; TC: traditional tillage and no-mulching without organic fertilizer application; TF: traditional tillage and no-mulching with organic fertilizer application.

2.3 冬小麥免耕覆蓋與有機(jī)栽培對(duì)土壤AM真菌豐富度和多樣性的影響

不同處理下土壤AM真菌群落豐富度指數(shù)(Chao1和ACE)均表現(xiàn)為TF>TC、NF>NC(表3), 而土壤AM真菌多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson)與豐富度指數(shù)(Chao1和ACE)則呈現(xiàn)出完全相反的變化趨勢(shì)。隨有機(jī)肥的施用, 免耕和傳統(tǒng)耕作處理下Shannon指數(shù)分別較不施肥處理下降8.40%和3.67%; 而Simpson指數(shù)則較有機(jī)肥施用處理分別下降了2.11%和3.26%。同時(shí), 免耕覆蓋處理中AM真菌多樣性指數(shù)(Shannon和Simpso)也明顯高于傳統(tǒng)耕作處理。但方差分析結(jié)果表明, 不同處理間土壤AM真菌多樣性及其豐富度指數(shù)均無顯著性差異。

表3 冬小麥免耕栽培對(duì)土壤AM真菌豐富度和多樣性指數(shù)的影響

不同小寫字母代表不同處理間差異在0.05水平上顯著。NC: 免耕覆蓋不施有機(jī)肥; NF: 免耕覆蓋施有機(jī)肥; TC: 傳統(tǒng)耕作不覆蓋不施有機(jī)肥; TF: 傳統(tǒng)耕作不覆蓋施有機(jī)肥。Different lowercase letters indicate significant differences among treatments at 0.05 level. NC: no-tillage and straw mulching without organic fertilizer application; NF: no-tillage and straw mulching with organic fertilizer application; TC: traditional tillage and no-mulching without organic fertilizer application; TF: traditional tillage and no-mulching with organic fertilizer application.

2.4 土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)及AM真菌多樣性與土壤理化及生物學(xué)性狀間的相互關(guān)系

土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤因子在影響微生物群落結(jié)構(gòu)組成的過程中, 彼此存在相互制約的關(guān)系。相關(guān)性分析表明(表4), 土壤全氮與AM真菌香濃指數(shù)呈顯著正相關(guān)(0.05); 速效鉀與AM真菌磷脂脂肪酸顯著負(fù)相關(guān)(<0.05); 脲酶與AM真菌多樣性指數(shù)(Simpson指數(shù))極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01), 與豐富度指數(shù)(ACE指數(shù))顯著正相關(guān)(<0.05); 易提取球囊霉素與土壤AM真菌中性脂生物量、AM真菌總生物量顯著正相關(guān)(<0.05)。

*和**分別代表0.05和0.01水平顯著相關(guān)。* and ** respectively represent significant correlations at 0.05 and 0.01 levels.NLFA: neutral lipid acid.

為進(jìn)一步分析不同土壤理化、生物學(xué)性狀對(duì)土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)及AM真菌多樣性的影響, 對(duì)AM真菌生物量、多樣性指數(shù)分別與土壤理化、生物學(xué)性狀做多元分析, 結(jié)果表明(圖1a-b): 第1、2排序軸能夠分別在累積變量90.48%、4.44%上解釋AM真菌與土壤因子的相關(guān)性及空間分布的差異性(圖1a)。各處理樣點(diǎn)空間分散較為明顯, 并位于不同象限, 說明不同管理措施下, 土壤因子在影響AM真菌分布的過程中, 彼此存在相互促進(jìn)或相互制約的復(fù)雜關(guān)系。圖1a顯示, 土壤AM真菌磷脂(菌絲體結(jié)構(gòu)脂)與堿性磷酸酶、全磷、有機(jī)質(zhì)、總球囊霉素呈正相關(guān); AM真菌總生物量與土壤有機(jī)質(zhì)和土壤易提取球囊霉素呈正相關(guān), 與土壤堿性磷酸酶活性負(fù)相關(guān); AM真菌中性脂(孢子貯存脂)、AM真菌的NLFA/PLFA比值與土壤pH、速效磷和全氮均呈正相關(guān)。

對(duì)連續(xù)冬小麥免耕覆蓋有機(jī)栽培2年(2017年)后, 不同處理下土壤AM真菌多樣性及豐富度與土壤因子進(jìn)行多元分析。結(jié)果顯示(圖1b)第1排序軸、第2排序軸分別在累積變量為41.45%和28.65%上解釋了不同處理間AM真菌多樣性、豐富度的空間變化; 假設(shè)性測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明(pseudo-=4.8,=0.006), 所有排序軸都是極顯著的; 第1排序軸對(duì)免耕覆蓋、有機(jī)栽培管理影響下的AM真菌豐富度累積差異變化解釋最多。與NC相比, TF和NF處理的AM真菌在空間分布上有明顯分散。土壤中的有機(jī)質(zhì)、全氮、總球囊霉素與土壤AM真菌豐富度指數(shù)(ACE和Chao1)呈正相關(guān); 土壤全磷與AM真菌的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系, 這說明土壤全磷含量的高低會(huì)抑制AM真菌多樣性和豐富度, 而外源有機(jī)碳的施入, 有利于增加AM真菌的豐富度。此外, AM真菌多樣性指數(shù)(Shannon與Simpson)與全氮、堿解氮和速效鉀呈正相關(guān), 且土壤速效鉀、堿解氮、全氮含量的高低也是影響AM真菌多樣性的主要驅(qū)動(dòng)因子。

TN、TP、AP、AN、AK和OM分別指土壤全氮、全磷、有效磷、堿解氮、速效鉀和有機(jī)質(zhì); URE、ALP、CAT、EE-GRSP、T-GRSP分別指脲酶、堿性磷酸酶、過氧化氫酶、易提取球囊霉素、總球囊霉素; AMN、AMP、AMT、NLFA/PLFA分別指AM真菌中性脂、AM真菌磷脂脂肪酸、AM真菌總生物量、中性脂與磷脂脂肪酸的比值; Chao1、ACE、Shannon、Simpson分別指Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)。圖中各形狀代表不同采樣點(diǎn)。NC表示免耕不施肥的3個(gè)重復(fù)(1~3), NF表示免耕施肥的3個(gè)重復(fù)(1~3), TC表示傳統(tǒng)耕作不施肥的3個(gè)重復(fù)(1~3), TF表示傳統(tǒng)耕作施肥的3個(gè)重復(fù)(1~3)。TN, TP, AP, AN, AK and OM refer to total nitrogen, total phosphorus, available phosphorus, available nitrogen, available potassium and organic matter; URE, ALP, CAT, EE-GRSP, T-GRSP refer to urease, alkaline phosphatase, catalase, easily extracted glomalin and total extracted glomalin; AMN, AMP, AMT, NLFA/PLFA refer to AM fungi neutral lipid acid, AM fungi phospholipid acid, AM fungi total biomass, neutral lipid acid and phospholipid acid ratio; Chao1, ACE, Shannon and Simpson refer to Chao 1 index, ACE index, Shannon index, and Simpson index, respectively. Each shape in the figure represents a sample. NC represents three replicates of treatment of no-tillage and straw mulching without organic fertilizer application (1-3), NF represents three replicates of treatment of no-tillage and straw mulching with organic fertilizer application (1-3), and TC represents three replicates of treatment of traditional tillage and no-mulching without organic fertilizer application (1-3), TF shows three replicates of treatment of traditional tillage and no-mulching with organic fertilizer (1-3).

3 討論

3.1 免耕覆蓋和施用有機(jī)肥對(duì)土壤主要微生物類群組成的影響

不同種類微生物特征PLFA的組成和含量的差異, 可用來直接評(píng)價(jià)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[20]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越復(fù)雜、物種越豐富, 則土壤生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)定, 系統(tǒng)的生態(tài)功能性越高[21]。何玉梅等[22]研究表明, 傳統(tǒng)耕作在一定程度上加快了養(yǎng)分礦化速度, 增強(qiáng)了土壤中真菌的活性, 使真菌生物量顯著增加, 這與本試驗(yàn)中傳統(tǒng)耕作施用(TF)或不施用(TC)有機(jī)肥下真菌生物量均高于對(duì)應(yīng)的免耕覆蓋處理一致。而Mathew等[20]研究指出, 土壤真菌、細(xì)菌、真菌/細(xì)菌、G+/G-的比值在0~5 cm土層中, 傳統(tǒng)耕作處理顯著高于免耕處理, 而5~15 cm土層的趨勢(shì)卻相反, 與本研究結(jié)果不一致。本研究發(fā)現(xiàn), 0~20 cm土層, 以特征PLFA表征的細(xì)菌、真菌、真菌/細(xì)菌和G+/G-的比值均表現(xiàn)為傳統(tǒng)耕作施肥(TF)顯著高于免耕覆蓋施肥(NF), 產(chǎn)生這種差異的原因可能是由于傳統(tǒng)耕翻處理中, 植物殘?bào)w、施入的有機(jī)肥隨人為耕翻擾動(dòng)而均勻地分布于耕作層中, 為土壤微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了豐富的可利用資源, 從而促進(jìn)了土壤微生物的繁殖和代謝[23]。但胡娜[24]的研究指出, 長(zhǎng)年免耕會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用, 但短期試驗(yàn)系統(tǒng)下, 多數(shù)研究認(rèn)為傳統(tǒng)耕作會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生輕度抑制, 而通常情況下傳統(tǒng)耕作會(huì)減少土壤中微生物總量。由此可見, 免耕覆蓋更有利于土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的增加。

此外, 相關(guān)研究認(rèn)為, 免耕顯著降低了真菌占細(xì)菌的比例, 主要是由于短期免耕降低了土壤生態(tài)緩沖能力, 降低了真菌的生物量。而秸稈還田則顯著提高了真菌與細(xì)菌生物量的比值[25], 主要是因?yàn)橥庠从袡C(jī)碳的輸入, 改善了微生物棲息環(huán)境, 提高了土壤生態(tài)緩沖能力, 為真菌的繁殖創(chuàng)造了有利的條件[26]。

3.2 免耕覆蓋和施用有機(jī)肥下的土壤AM真菌多樣性與土壤環(huán)境因子之間的相互關(guān)系

農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中AM真菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)受到耕作措施等諸多因素的影響[27]。試驗(yàn)結(jié)果表明, 隨免耕年限的延長(zhǎng), 土壤AM真菌總生物量、AM真菌中性脂(孢子體)的生物量整體呈增加趨勢(shì), 而AM真菌磷脂(菌絲體)生物量整體有降低趨勢(shì)。相關(guān)研究表明, 這主要是由于施有機(jī)肥對(duì)AM真菌生長(zhǎng)及孢子繁殖會(huì)產(chǎn)生正效應(yīng), 對(duì)菌絲會(huì)產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)的緣故[28]。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn), AM真菌結(jié)構(gòu)組成主要受不同土層深度的影響, 而不受農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)管理活動(dòng)的影響[29]。但Qin等[30]認(rèn)為, 長(zhǎng)期向農(nóng)田施化肥會(huì)直接影響土壤AM真菌生物量及AM真菌占總磷脂脂肪酸的比例, 增加AM真菌孢子生物量。本試驗(yàn)中, 傳統(tǒng)耕作施有機(jī)肥(TF)增加了AM真菌磷脂(菌絲體)生物量及AM真菌占微生物總PLFA的比值, 而免耕覆蓋不施有機(jī)肥(NC)卻降低了兩者的生物量, 這與之前的研究結(jié)果并不完全相同。這些相互矛盾的研究結(jié)果說明, 土壤AM真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)很可能是由諸多環(huán)境因素(如: 耕作方式、施肥類型、覆蓋方式、土層深度)等綜合作用的結(jié)果, 而不是單一因素制約的結(jié)果。

AM真菌對(duì)外來擾動(dòng)比較敏感, 通常被視作農(nóng)業(yè)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展中土壤肥力的重要潛在指標(biāo)[31]。農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中, AM真菌群落組成的改變以及多樣性的降低, 是區(qū)域耕作措施、施肥方式以及植保技術(shù)等方面的綜合反映[32]。農(nóng)業(yè)管理活動(dòng)不僅會(huì)減少AM真菌豐富度, 而且會(huì)影響AM真菌多樣性, 導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[27]。Gajda等[33]發(fā)現(xiàn), 與傳統(tǒng)耕作相比, 在麥稈覆蓋情況下, 少耕增加了AM真菌多樣性, 其分析認(rèn)為是由于少耕使整個(gè)土壤剖面的含水量增加、易分散黏土含量降低、表層土壤穩(wěn)定性提高, 有利于土壤AM真菌的生長(zhǎng)。14年保護(hù)性耕作條件下的AM真菌多樣性研究結(jié)果表明, 免耕土壤中的AM真菌多樣性顯著高于耕作處理[34], 在不擾動(dòng)情況下, 土壤中AM真菌多樣性更高, 土壤擾動(dòng)與AM真菌多樣性降低有關(guān)[35]?？梢? 實(shí)施保護(hù)性耕作措施的時(shí)間越長(zhǎng), 越有利于AM真菌多樣性的提高。這與本研究結(jié)果有一致的地方。而Shen等[36]卻發(fā)現(xiàn), 傳統(tǒng)耕作措施下, 不同覆蓋方式和有機(jī)無機(jī)肥配施均可以顯著增加AM真菌的多樣性指數(shù)。但本試驗(yàn)中, 免耕覆蓋增加了AM真菌多樣性卻降低了豐富度; 同時(shí), 施用有機(jī)肥促進(jìn)了AM真菌豐富度的升高, 降低了多樣性指數(shù)。但不同處理之間, AM真菌豐富度、多樣性之間并無顯著性差異。分析認(rèn)為, 有機(jī)肥施用對(duì)AM真菌豐富度和多樣性所產(chǎn)生的效應(yīng)可能與持續(xù)免耕覆蓋、有機(jī)肥管理及傳統(tǒng)耕作時(shí)間的長(zhǎng)短有一定的關(guān)系。此外, Xiang等[37]和Hazard等[38]指出不同時(shí)空尺度下氣候因子(如: 溫度、降水等)和土壤理化因子(如: pH、有效磷、土壤有機(jī)質(zhì)等)也會(huì)對(duì)土壤AM真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響。如宋福強(qiáng)等[39]指出氮施加會(huì)顯著降低土壤pH, 進(jìn)而對(duì)土壤中AM真菌群落的多樣性和均勻度產(chǎn)生影響, 但不同AM真菌對(duì)土壤pH的響應(yīng)也各不相同。

為探究影響AM真菌群落結(jié)構(gòu)及AM真菌多樣性的主要環(huán)境因子, 繪制多元分析圖, 發(fā)現(xiàn)土壤AM真菌生物量、豐富度指數(shù)均與土壤有機(jī)質(zhì)、易提取球囊霉素有正相關(guān)關(guān)系。這可能是由于土壤有機(jī)質(zhì)的組成成分與生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)及土壤中各類生物的活性有關(guān)[40]。此外, 本研究并沒有發(fā)現(xiàn)全磷會(huì)對(duì)AM真菌多樣性產(chǎn)生顯著影響, 這與?milauer[41]認(rèn)為土壤磷與AM真菌群落結(jié)構(gòu)或多樣性并沒有顯著相關(guān)關(guān)系是一致的。但與以往的大多數(shù)施磷肥對(duì)AM真菌研究結(jié)果存在相互矛盾[42-43]。如Hijri等[44]發(fā)現(xiàn)AM真菌群落多樣性與土壤磷含量呈顯著對(duì)應(yīng), 且Shannon指數(shù)隨著磷含量的增加而減少。根系中AM真菌豐度也隨之顯著減少(<0.05),但與土壤中AM真菌豐度和Chao多樣性不相關(guān)[45]。另外, 堿性磷酸酶直接表征AM真菌磷代謝活力[46]且與AM真菌群落Shannon指數(shù)呈顯著正相關(guān)[47], 與本試驗(yàn)結(jié)果不一致, 具體原因需進(jìn)一步探究。因此, 作為植物與土壤環(huán)境之間溝通的橋梁, AM真菌群落結(jié)構(gòu)必然會(huì)受到植物和土壤因子的直接或間接影響, 但AM真菌無論是以單一物種存在, 還是以生態(tài)系統(tǒng)中不同物種群落存在, 土壤氮、磷的有效性都應(yīng)該是AM真菌群落結(jié)構(gòu)和功能的重要驅(qū)動(dòng)因素; 持續(xù)免耕覆蓋栽培管理過程中, 土壤理化性質(zhì)、生物學(xué)特性的改變應(yīng)該是導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及AM真菌多樣性變化的重要因素。

4 結(jié)論及展望

免耕覆蓋栽培顯著增加了以特征PLFA表征的土壤細(xì)菌和G+生物量; 隨免耕覆蓋年限延長(zhǎng), 土壤AM真菌總生物量提高。免耕覆蓋、有機(jī)栽培管理措施通過改變AM真菌菌絲及孢子中生物量碳的分配比例關(guān)系而影響AM真菌的生物量特征。與傳統(tǒng)耕作相比, 免耕覆蓋措施提高了土壤AM真菌多樣性指數(shù), 降低了豐富度指數(shù); 而傳統(tǒng)耕作在有機(jī)肥施用下卻使AM真菌豐富度提高、多樣性降低。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及AM真菌多樣性變化受農(nóng)業(yè)管理措施導(dǎo)致的土壤理化及生物學(xué)性狀差異等綜合因素的影響。

總之, 目前雖然關(guān)于農(nóng)田、森林、草原、荒漠以及重金屬污染等土壤中AM真菌群落結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了廣泛的關(guān)注, 但農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)受人為耕種措施的擾動(dòng)最大, 使得AM真菌根外菌絲生物量、孢子密度以及群落組成和多樣性等對(duì)不同耕種措施的響應(yīng)變得敏感而復(fù)雜, 進(jìn)而影響作物共生體的效應(yīng)。因此, 無論是從研究方法還是研究?jī)?nèi)容上關(guān)于以免耕為主的保護(hù)性耕作措施對(duì)土壤主要微生物群落及AM真菌群落結(jié)構(gòu)的影響仍存在很多值得進(jìn)一步探討的問題。

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Effects of no-tillage, mulching and organic fertilization on soil microbial composition in winter wheat field*

WANG Xiaoling1,2, MA Kun1**, WANG Zhiqin1,2, LI Yue2, WEI Changhui2

(1. College of Agronomy, Ningxia University, Yinchuan 750021, China; 2.National Key Laboratory Breeding Base of Northwest Land Degradation and Ecological Restoration, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)

Soil micro-organisms constitute a significant part of soil fertility and play a critical role in maintaining soil ecological functions. Micro-organisms also are key indicators for soil quality and productivity. No-tillage and mulching cultivation indirectly affect the composition of soil microbial community by changing plant physiological characteristics and root exudates. The two agronomic practices can also improve soil environment by increasing the total amount of micro-organisms in the soil. By analyzing the composition of soil microbial community under no-tillage, mulching and organic cultivation of winter wheat in the southern mountain areas of Ningxia, the effects of agricultural management activities on soil microbial community structure and arbuscular mycorrhizal (AM) fungal diversity were determined in this paper. The study aimed at providing theoretical basis for the promotion of long-term no-tillage, mulching cultivation, sustainable use of farmlands and maintenance of soil microbial diversity. Short-term test on conservation tillage (no-tillage) was done for three consecutive years in Longde County, Guyuan. Four soil treatments were selected including no-tillage and straw mulching without organic fertilizer application (NC), no-tillage and straw mulching with organic fertilizer application (NF), traditional tillage and no-mulching without organic fertilizer application (TC) and traditional tillage and no-mulching with organic fertilizer application (TF). By using Illumina Miseq high-throughput sequencing platform and phospholipid fatty acids (PLFAs) analysis methods, soil microbial community composition, AM fungi community composition and diversity and soil environmental factors were analyzed after three years cultivation of winter wheat. The results showed that continuous no-tillage, mulching and organic fertilizer application increased soil microbial community biomass characterized by PLFA. Traditional tillages significantly improved microbial community biomass (< 0.05) of gram-positive (G+) and negative (G-) bacteria in the soil. With increasing years of management of no-tillage and straw mulching, soil AM fungi biomass significantly increased. Also biomass ratios of 16:1ω5c neutral lipid (NLFA) to 16:1ω5c phospholipid lipid (PLFA) significantly increased (< 0.05). Under no-tillage and straw mulching, the application of organic fertilizer increased soil AM fungi richness index (Chao1 index and ACE index), but reduced soil AM fungi diversity (Shannon index and Simpson index). The results of principal component analysis showed that biomass of AM fungal spores (16:1ω5 c neutral fat) was positively correlated with soil contents of organic matter, and easily extracted glomalin. While AM fungi richness index was positively correlated with soil organic matter content, AM fungi diversity index was positively correlated with soil total nitrogen content and urease activity. AM fungi richness and diversity were affected by soil physical and chemical properties and soil biological differences. Also soil microbial biomass changed along with AM fungal diversity and richness. It was concluded that no-tillage and straw mulching cultivation increased soil AM fungi diversity. The proportion of NLFA to PLFA biomass of AM fungi was also significantly affected by the application of organic fertilizer, and changed distribution of biomass carbon between AM fungi spores and mycelium.

No-tillage and straw mulching; Organic cultivation; Winter wheat; Microbial community; Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF); Environmental factors

, E-mail: makun0411@163.com

Jun. 24, 2018;

Sep. 30, 2018

S314

A

2096-6237(2019)02-0267-10

10.13930/j.cnki.cjea.180583

* 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31660132, 31160104)和寧夏高等學(xué)校一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(NXYLXK2017B06)資助

馬琨, 研究方向?yàn)檗r(nóng)田生態(tài)學(xué)和土壤微生物生態(tài)學(xué)。E-mail: makun0411@163.com

王小玲, 研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)。E-mail: 928176524@qq.com

2018-06-24

2018-09-30

* This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31660132, 31160104) and the First-class Discipline Construction Project of Colleges and Universities in Ningxia (NXYLXK2017B06).

王小玲, 馬琨, 汪志琴, 李越, 魏常慧. 冬小麥免耕覆蓋與有機(jī)栽培對(duì)土壤微生物群落組成的影響[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)(中英文), 2019, 27(2): 267-276

WANG X L, MA K, WANG Z Q, LI Y, WEI C H. Effects of no-tillage, mulching and organic fertilization on soil microbial composition in winter wheat field[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2019, 27(2): 267-276