蘭玉菲，叢倩倩，崔 曉

（泰安市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 泰安 271000）

金針菇[Flammulina velutipes（Fr.）Singer]是我國重要的栽培食用菌之一，其營養(yǎng)豐富、味道鮮美，尤其富含賴氨酸和精氨酸，被稱為“益智菇”[1-2]，深受人們喜愛。

近年來隨著金針菇種植規(guī)模的逐年增大，蛛網(wǎng)病發(fā)生和危害呈加重趨勢，已成為金針菇生產(chǎn)中污染嚴重的真菌病害之一。在工廠化周年栽培廠房內(nèi)和農(nóng)戶菇棚中子實體的發(fā)育時期均可發(fā)生。該病一旦發(fā)生，蔓延迅速，毀滅性強，同時會產(chǎn)生大量孢子，給金針菇種植企業(yè)和菇農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟損失。為了明確引起該病害的病原，筆者對病原菌進行了分離和鑒定，明確了病原菌的分類地位，以期為該病害的科學防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌采集

發(fā)病樣品采自濟寧市金鄉(xiāng)縣金針菇菇棚內(nèi)。

1.2 病原菌的分離純化

無菌環(huán)境下，將采集的感病子實體的病健交界處組織接種于PDA培養(yǎng)基（涂布有2滴～3滴25%乳酸）上，黑暗培養(yǎng)。菌絲萌發(fā)后進行3次純化得到純培養(yǎng)，編號為JN，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測定

將JN菌株活化培養(yǎng)10 d～12 d后，用無菌水制備孢子懸浮液（每毫升1×106），采用噴霧法接種，定期觀察發(fā)病情況。從接種發(fā)病的金針菇上重新分離病原菌，確定是否為同一病原菌。以無菌水噴灑到健康子實體為對照[3-4]。

1.4 形態(tài)學鑒定

觀察并記錄病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征、菌落顏色變化等。顯微觀察菌絲特征和分支情況，孢子形態(tài)和大小等并拍照。

1.5 分子生物學鑒定

制備病原菌菌絲體并提取其基因組總DNA，具體方法參照文獻[5]；利用ITS1/ITS4真菌ITS區(qū)域擴增的通用引物[6]進行PCR擴增，PCR反應體系和程序參照文獻 [5]；將PCR產(chǎn)物測序后所得到的DNA序列輸入GenBank進行Blast檢索，利用DNAMAN、MEGA等軟件對該病原菌ITS序列與GenBank中收錄分離物的ITS序列進行比較和分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀特征

病原菌對金針菇子實體的為害癥狀見圖1。

圖1 病原菌對金針菇子實體的為害癥狀Fig.1 Symptom of cobweb disease on Flammulina velutipes fruiting bodies

病害癥狀如圖1A和圖1B，主要癥狀表現(xiàn)為在金針菇催蕾期，菇蕾上出現(xiàn)肉眼可見的白色絮狀物，隨著子實體的生長發(fā)育，白色絮狀物將整個子實體覆蓋住，并產(chǎn)生大量的分生孢子，最后導致子實體倒伏、腐爛。

2.2 病原菌致病性測定

試驗結(jié)果表明，分離的病原菌接種到健康金針菇子實體上發(fā)病后的癥狀（圖1C和圖1D） 與栽培條件下采集的病害樣品癥狀完全一致（圖1A和圖1B）；而對照組子實體未表現(xiàn)出病害癥狀。從人工接種發(fā)病的金針菇子實體上再次分離得到病原菌，且性狀與接種物相同。證明菌株JN為金針菇蛛網(wǎng)病的病原菌。

2.3 病原菌分離和形態(tài)特征觀察

菌株JN的菌落和形態(tài)特征見圖2。

圖2 菌株JN的菌落和形態(tài)特征Fig.2 Colony and morphology of JN strain

菌株JN在PDA培養(yǎng)基上初期菌絲潔白濃密，菌落邊緣整齊，后期有粉狀分生孢子產(chǎn)生；菌絲培養(yǎng)后期不產(chǎn)生色素，菌落背面無色（圖2A～2C）。病原菌絲為有隔菌絲，在菌絲上形成分生孢子梗，分生孢子梗分枝并輪生，在小梗頂端形成分生孢子，分生孢子呈橢圓形，單細胞或雙細胞，大小為（12.4～16.8）μm× （6.4～8.6）μm，無色透明 （圖 2D）。

2.4 病原菌ITS的序列測定與分析

用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的相關(guān)Hypomyces屬菌株和ITS序列以及構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹分別見表1和圖3。

以病原菌總DNA為模板，PCR擴增后得到長度約為600 bp的目的片段。測序結(jié)果表明擴增產(chǎn)物長度為574 bp（GenBank登錄號為MH607599），其中包括18S rDNA基因序列21 bp、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1） 176 bp、5.8S編碼序列157 bp、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 2（ITS2）200 bp和 28S rDNA 20 bp。經(jīng)與 Gen-Bank中相關(guān)基因序列（表1） 進行同源性比對，菌株JN與GenBank中引起韓國斑玉蕈蛛網(wǎng)病的病原Hypomyces aurantius（AB591044） 同源性最高，核苷酸一致率為99.81%。進一步構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)菌株J N與GenBank中來自于不同國家的H.aurantius的6個分離物聚為一簇，組內(nèi)核苷酸一致率為98.26%～99.81%，而與枝葡孢屬（Cladobotryum） 其他種 （Cladobotryum dendroides、Cladobotryum mycophilum和Cladobotryum semicirculare） 的核苷酸一致率為87.72%～90.61%（如圖3所示）。結(jié)合形態(tài)特征，將JN菌株鑒定為金黃菌寄生H.aurantius（無性型Cladobotryum varium）。

表1 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的相關(guān)Hypomyces屬菌株和ITS序列登錄號Tab.1 Related strains of Hypomyces used in phylogenetic analysis and their ITSsequence accession number

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITSsequences and constructed using the neighbor-joining method

3 討論

菌寄生屬（Hypomyces） 建立于1860年，隸屬于子囊菌門 （Ascomycota） 糞殼菌綱 （Sordariomycetes） 肉座菌目 （Hypocreales） 肉座菌科（Hypocreaceae），該屬真菌具有重寄生性，通常生長于多孔菌、牛肝菌、傘菌和盤菌等真菌的子實體上，無性階段主要包括枝葡孢屬（CladobotryumNees）、瘤孢屬（SepedoniumLink）、疣孢霉屬（MycogoneLink） 等[7-8]。

本研究對山東省金針菇病害的病原學進行了研究，通過分子鑒定并結(jié)合形態(tài)特征，證明該病害為金針菇蛛網(wǎng)病，病原為金黃菌寄生菌Hypomyces aurantius（Pers.）Fuckel（無性型：Cladobotryum variumNees）。

在我國Teng[9]首次報道了該病菌；蔡為明等[10]報道Cladobotryum varium引起金針菇軟腐病；張琪輝等[11]報道該病菌引起斑玉蕈蛛網(wǎng)病并造成嚴重損失；Chang等[4，12]報道在韓國雙孢蘑菇和斑玉蕈工廠中也發(fā)現(xiàn)了該病菌。蛛網(wǎng)病是由Cladobotryum屬/Hypomyces屬真菌侵染引起的食用菌病害，該病可危害多種食用菌，在歐洲、美洲和亞洲等地區(qū)均有報道[11]，筆者首次在中國發(fā)現(xiàn)Cladobotryum mycophilum引起雙孢蘑菇蛛網(wǎng)病，并對其生物學特性、發(fā)生特點和防控技術(shù)進行了研究[13-15]。本研究首次利用分子生物學手段對山東省金針菇蛛網(wǎng)病病原進行了鑒定，明確了其病原，為該病害的防治奠定理論基礎(chǔ)。關(guān)于金針菇蛛網(wǎng)病病原菌的生物學特性、發(fā)生特點和防控技術(shù)還有待于進一步研究。