胡斌，王成舉，陳鵬慧，張雨平

(1 陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院，重慶400037；2 陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

腦白質(zhì)損傷是早產(chǎn)兒特有的腦損傷形式之一。最嚴(yán)重的結(jié)局是早產(chǎn)兒腦室旁白質(zhì)軟化,會(huì)造成腦癱、視聽功能異常、認(rèn)知障礙等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。目前腦白質(zhì)損傷的具體發(fā)生機(jī)制尚不明確。神經(jīng)束蛋白155(neurofascin155，NF155)主要存在于膠質(zhì)細(xì)胞中，是神經(jīng)束蛋白(neurofascin，NF)家族成員之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞及其前體細(xì)胞中[1]。NF155的表達(dá)始于髓鞘形成初期，在整個(gè)髓鞘形成期間持續(xù)高表達(dá)，隨著少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育逐漸成熟，NF155從胞體向細(xì)胞突起末端遷移，最終分布于成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘結(jié)側(cè)區(qū)脂筏中[2]。研究[3,4]發(fā)現(xiàn)，NF155在髓鞘形成及損傷后的修復(fù)過程中起到重要作用，并且與多種自身免疫性脫髓鞘疾病中的髓鞘病變相關(guān)。我們前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血腦白質(zhì)損傷早產(chǎn)模型大鼠腦組織中髓鞘量減少、軸突萎縮導(dǎo)致神經(jīng)功能異常，與NF155的表達(dá)缺失有關(guān)，在缺氧缺血損傷早期補(bǔ)充NF155，很可能對(duì)腦白質(zhì)損傷具有預(yù)防甚至修復(fù)作用。因此，NF155有可能成為腦白質(zhì)損傷干預(yù)治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。為此，2017年9月～2018年1月，我們構(gòu)建了NF155高表達(dá)的少突膠質(zhì)細(xì)胞模型，并驗(yàn)證NF155的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究NF155在髓鞘損傷及修復(fù)中的作用和機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、pUM-T simple vector克隆試劑盒、2×Taq PCR MasterMix購自BioTeke公司；PCR試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、β-actin購自碧云天生物技術(shù)研究所；NheⅠ、AgeⅠ限制性內(nèi)切酶購自Fermetas公司；NF155抗體購自CST公司；細(xì)胞培養(yǎng)DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；少突膠質(zhì)細(xì)胞由本課題組取新生大鼠大腦皮層原代培養(yǎng)，新生SD大鼠購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；感受態(tài)細(xì)菌E.colin DH5α、T4連接酶為實(shí)驗(yàn)室留存；引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 NF155慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.1 目的基因及引物設(shè)計(jì)合成 從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫獲取NF155的DNA序列，引物序列設(shè)計(jì)如下，NF155上游引物5′-CAAGCTAGCATGGCCAGGCAGCAGGCGCCA-3′，NF155下游引物5′-CGCACCGGTTCAGGCCAGGGAATAGATGGC-3′，下劃線部分分別為NheⅠ、AgeⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。以目的片段為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下，NF155上游引物和NF155下游引物各取1 μL，模板2 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)條件如下，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s 30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

1.2.2 NF155慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 取NheⅠ、AgeⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pUM-T simple vector克隆載體，用1 %瓊脂糖凝膠回收酶切產(chǎn)物，連接目的片段和載體片段，反應(yīng)體系如下，載體片段1 μL，目的片段1 μL，T4 連接酶1 μL，buffer 5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至10 μL；反應(yīng)條件為22 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)20 h。挑選單克隆菌落接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)過夜。抽提質(zhì)粒送沈陽萬類生物科技有限公司測序。 NF155慢病毒載體質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ、AgeⅠ雙酶切，1 %瓊脂糖凝膠電泳后可見兩條3 723、8 083 bp的片段，表明NF155與pUM-T simple載體連接成功。經(jīng)沈陽萬類生物科技有限公司測序，與GeneBank中NF155的基因序列一致，表明NF155慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.3 NF155慢病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的少突膠質(zhì)細(xì)胞NF155 mRNA及蛋白檢測

1.3.1 少突膠質(zhì)細(xì)胞分組及NF155慢病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法 取對(duì)數(shù)生長期少突膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔板中，用不含抗生素的無血清培養(yǎng)基于37 ℃、5 % CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性慢病毒感染組、NF155慢病毒感染組。空白對(duì)照組不做任何處理，陰性慢病毒感染組給予10 μL空載體慢病毒+100 μL培養(yǎng)基，NF155慢病毒感染組給予10 μL慢病毒載體質(zhì)粒+100 μL培養(yǎng)基。37 ℃、5 % CO2條件繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.3.2 三組細(xì)胞NF155 mRNA檢測 采用熒光定量PCR法。取轉(zhuǎn)染后的少突膠質(zhì)細(xì)胞提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，SYBR Green 0.3 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)條件如下，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 150 s，40 ℃ 90 s，60 ℃-94 ℃每1 ℃ 1 s，25 ℃ 120 s。以2-ΔΔCt代表CG5844基因的相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 三組細(xì)胞NF155蛋白檢測 采用Western blotting法。收集轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞時(shí)，先用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗三次，加入含0.4 %蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰浴30 min后用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞，移至離心管中，于4 ℃、14 000 r/min離心15 min收集上清。加入0.2倍體積的6×上樣buffer，100 ℃沸水煮5 min，上樣于SDS-PAGE。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后于5 %脫脂牛奶中封閉2 h。滴加相應(yīng)的NF155抗體、β-actin抗體，4 ℃搖床孵育過夜。然后，用TBST清洗8 min×3次后，滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h。用TBST清洗8 min×3次后，將發(fā)光液A液和B液按1∶1混合均勻后滴加于PVDF膜表面，Quantity One曝光。以目的條帶灰度值與β-actin灰度值代表NF155蛋白的相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

NF155慢病毒感染組、空白對(duì)照組、陰性慢病毒感染組NF155 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.25±0.11、1.00±0.06、1.08±0.01，與空白對(duì)照組、陰性慢病毒感染組比較，NF155慢病毒感染組NF155 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P均<0.05)。

NF155慢病毒感染組、空白對(duì)照組、陰性慢病毒感染組NF155 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.57±0.08、0.51±0.12、0.50±0.06，與空白對(duì)照組、陰性慢病毒感染組比較，NF155慢病毒感染組NF155蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P均<0.05)。

3 討論

神經(jīng)元軸突的髓鞘化完成標(biāo)志著神經(jīng)發(fā)育成熟。髓鞘的生理功能主要體現(xiàn)在對(duì)神經(jīng)元軸突的保護(hù)和絕緣作用，并在此基礎(chǔ)上確保神經(jīng)沖動(dòng)通過跳躍式傳導(dǎo)而高速傳遞[6]。然而在腦白質(zhì)損傷中，由于髓鞘損傷或發(fā)育不良，使其生理功能完全或部分喪失，導(dǎo)致一系列病理生理改變。腦白質(zhì)損傷引起的神經(jīng)纖維脫髓鞘包括了原發(fā)性脫髓鞘和繼發(fā)性脫髓鞘，諸如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)和腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的原發(fā)性脫髓鞘病變多由免疫介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)或因遺傳因素所引起；而繼發(fā)性脫髓鞘病變則是由于感染、中毒、外傷、腫瘤等因素所引起；這些病變的發(fā)生與髓鞘的穩(wěn)定性、抗原性等特性密切相關(guān)，而主要取決于髓鞘結(jié)構(gòu)中的一些重要的黏附分子[7～9]。

神經(jīng)束蛋白是Rathjen等[10]1987年在雞的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種參與神經(jīng)束形成的細(xì)胞表面蛋白，其結(jié)構(gòu)包括6個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域、5個(gè)NFIII樣結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)與免疫球蛋白超家族(IgSF)的成員極其相似，如神經(jīng)細(xì)胞黏附分子L1和類L1同源物、NgCAM相關(guān)黏附分子(NrCAM)[11]。目前在人類和各類動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)有NF140、NF155、NF166、NF180和NF186等5種不同的神經(jīng)束蛋白多肽類型[12,13]，它們的表達(dá)受到時(shí)間和空間的調(diào)控，既可在胚胎或成體中表達(dá)，又可在神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，或獨(dú)立、或與細(xì)胞內(nèi)外不同的蛋白相互作用影響著不同的細(xì)胞進(jìn)程[14]。NF166和NF180都只在未成熟的神經(jīng)元中表達(dá)，主要功能是選擇性地調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突的生長，Lustig等[15]研究證明NF166和NF180在軸突起始段和郎飛結(jié)處高度富集，聯(lián)合Na+通道，共同作用于軸突電位和信號(hào)傳導(dǎo)的啟動(dòng)過程；隨著大腦發(fā)育的成熟，NF186的表達(dá)逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，其功能主要是通過干擾并減少軸突起始段的突觸數(shù)量而使神經(jīng)元保持穩(wěn)定，F(xiàn)einberg等[16]的研究表明NF186作用于Na+通道無髓鞘節(jié)段的β1和β3亞基聚集處，直接影響髓鞘郎飛結(jié)結(jié)側(cè)區(qū)的信號(hào)傳導(dǎo)，在神經(jīng)纖維的神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元跳躍式傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著獨(dú)特作用；NF140是2017年Dolmont等在慢性炎性脫髓鞘神經(jīng)病(CIDP)患者血清中新發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)束蛋白多肽亞型，其結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能尚待進(jìn)一步的研究[12]；本研究構(gòu)建的神經(jīng)束蛋白多肽亞型NF155，在結(jié)構(gòu)方面通過微外顯子的排他表達(dá)區(qū)別于其他神經(jīng)束蛋白亞型[17]。NF155的生物學(xué)功能一方面表現(xiàn)在軸突起始段的形成早期發(fā)揮著重要的作用，Pomicter等[18]研究發(fā)現(xiàn)NF155表達(dá)缺失可造成軸突起始段形成障礙而導(dǎo)致小鼠表現(xiàn)出明顯的共濟(jì)失調(diào)和神經(jīng)傳導(dǎo)速度下降；另一方面，NF155在髓鞘結(jié)構(gòu)的形成和損傷后的修復(fù)過程中起到關(guān)鍵作用，Sherman等[19]研究發(fā)現(xiàn)NF155能招募和聚集caspr、contactin，在結(jié)側(cè)區(qū)形成復(fù)合物維持髓鞘結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，在caspr-/-和contactin-/-小鼠中，NF155尚且能在結(jié)側(cè)區(qū)聚集，但在NF155-/-小鼠中，盡管caspr和contactin總量未減少，但卻無法聚集于結(jié)側(cè)區(qū)；Mathey等[20]研究亦發(fā)現(xiàn)NF155對(duì)髓鞘損傷后的修復(fù)功能可以作為治療自身抗體介導(dǎo)的軸突損傷新靶點(diǎn)。NF155在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的發(fā)育、穩(wěn)定及修復(fù)中均發(fā)揮著重要作用。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前應(yīng)用于目的基因轉(zhuǎn)染的病毒載體主要包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體[21]。慢病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個(gè)亞型，它有著更廣泛的宿主，對(duì)分裂期及非分裂期細(xì)胞均具有感染能力，對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞，可極大提高目的基因的轉(zhuǎn)染效率，且載體容量大，可攜帶并整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的目的基因?qū)罐D(zhuǎn)錄沉默作用，在靶細(xì)胞中得到持續(xù)高效穩(wěn)定的表達(dá)，此外慢病毒載體中還可以插入組織細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，提高轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)錄靶向性，使慢病毒載體中的目的基因在特定的組織細(xì)胞中表達(dá)，基于上述諸多優(yōu)點(diǎn)，慢病毒載體被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)以及疾病的基因治療等方面的研究中[22]。

本研究成功構(gòu)建了NF155慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)過酶切鑒定達(dá)到預(yù)期效果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)建的NF155慢病毒表達(dá)載體在過表達(dá)NF155方面的有效性，我們用重組的NF155慢病毒表達(dá)載體感染了少突膠質(zhì)細(xì)胞，相較于空白對(duì)照組和陰性慢病毒感染組，NF155慢病毒感染組細(xì)胞中NF155 mRNA及其蛋白表達(dá)量均增高，進(jìn)一步證實(shí)NF155高表達(dá)瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞模型的成功建立。這一研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究NF155對(duì)腦白質(zhì)損傷髓鞘形成及損傷修復(fù)等病理生理過程的影響，探究NF155在腦白質(zhì)損傷髓鞘形成及修復(fù)中的作用和機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。