黃少江，閻呂軍，牛凱，李青

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院，重慶400037)

結(jié)直腸癌是消化道常見(jiàn)的腫瘤之一，目前手術(shù)切除是治療結(jié)直腸癌最有效的方式，然而只有少數(shù)早期結(jié)直腸癌患者才能采用根除手術(shù)治療[1]，且手術(shù)后的腫瘤復(fù)發(fā)率仍較高，5年生存率很低[2]。研究證實(shí)，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中存在多種基因和其編碼蛋白的改變，越來(lái)越多的證據(jù)顯示長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)的異常表達(dá)在結(jié)直腸癌的發(fā)生、遷移和侵襲中有重要作用[3, 4]。LncRNAs是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核酸的RNA，能夠識(shí)別互補(bǔ)序列，在RNA的轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程中有重要的意義，這些轉(zhuǎn)錄后加工的過(guò)程包括剪切、編輯、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯以及降解[5]。研究[6, 7]顯示，LncRNA ?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)在胃癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤中發(fā)揮調(diào)控作用。也有研究[8, 9]顯示,TUG1在結(jié)直腸癌中明顯高表達(dá)并影響結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，然而其具體作用機(jī)制尚未完全明確。本研究首先觀察了LncRNA TUG1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，然后探討了干擾其表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑 結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、HCT-116、SW620和LoVo細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系FHC細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。RPMI1640和L-15細(xì)胞培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；FBS(Sigma-Aldrich公司)；總RNA提取試劑盒(Takara公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green、熒光試劑、引物(Qiagen公司)；兔抗細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白2(Smad2)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)(Cell Signaling公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與siRNA-TUG1轉(zhuǎn)染 SW480、SW620和LoVo細(xì)胞采用含10%胎牛血清的L-15細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；HCT-116和FHC細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；放置于37 ℃、5% CO2平衡濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并進(jìn)行換液。將轉(zhuǎn)染siRNA-TUG1的細(xì)胞分為siRNA-TUG1組，轉(zhuǎn)染siRNA-NC的細(xì)胞分為siRNA-NC組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000方法。轉(zhuǎn)染前1 d，分細(xì)胞至6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1×106/孔，每孔中加入不加抗生素的培養(yǎng)基1.5 mL，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度為30%～50%。其具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞中TUG1、TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR法。按照TRIzol試劑盒步驟提取結(jié)直腸癌細(xì)胞中總RNA，使用分光光度儀檢測(cè)RNA濃度。GAPDH為內(nèi)參。qRT-PCR按照SYBR Green試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用比較CT值法對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。TUG1在SW480、HCT-116、SW620、LoVo、正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC中的表達(dá)分別為1.79±0.05、2.31±0.18、2.99±0.21、3.45±0.08、1.04±0.05，SW480、HCT-116、SW620、LoVo細(xì)胞中TUG1表達(dá)高于FHC細(xì)胞(P均<0.05)，SW620和LoVo細(xì)胞中TUG1的表達(dá)高于其他結(jié)直腸癌細(xì)胞(P均<0.05),SW620和LoVo細(xì)胞作為后續(xù)試驗(yàn)的研究對(duì)象。

1.2.3 各組細(xì)胞增殖觀察 采用CCK-8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接種到96孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 和96 h后，加人10 μL的CCK-8溶液，孵育10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm波長(zhǎng)的吸光度值。

1.2.4 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力觀察 采用Transwell法。在SW620和LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，以1×104個(gè)/孔接種于24孔板Transwell中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并在上室加入200 μL RPMI1640培養(yǎng)基，下室加入600 μL RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h后取出上室，并吸取下室中培養(yǎng)液，加入結(jié)晶紫染色液100 μL/孔，染色10 min，PBS洗滌2遍，100倍顯微鏡下選取10個(gè)視野,計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞,取平均值。在侵襲分析中，小室以基質(zhì)膜包被，后續(xù)試驗(yàn)同遷移步驟。100倍顯微鏡下選取10個(gè)視野,計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞,取平均值。

1.2.5 各組細(xì)胞周期分析和凋亡觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以3×105個(gè)/孔接種于6孔板，胰酶消化收集轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞，PBS洗滌后制備成細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的70% 乙醇，4 ℃固定過(guò)夜。加入PBS洗滌2次后棄上清，加入PI工作液，室溫下避光孵育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶染色液(0.25 mg/mL)，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

1.2.6 各組細(xì)胞培養(yǎng)液TGF-β、Smad2、α-SMA蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量，調(diào)節(jié)每份樣品蛋白濃度，在上樣緩沖液加入等量蛋白，煮沸，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液室溫封閉3 h，分別加入TGF-β、Smad2、α-SMA和GAPDH一抗4 ℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光劑檢測(cè)轉(zhuǎn)印膜上靶蛋白信號(hào)，具體操作按ECL說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，然后于暗室中用膜對(duì)X線(xiàn)片曝光，所得X線(xiàn)片上的信號(hào)條帶用吸光度圖像掃描儀掃描采集圖片，采用AlphaEase FC軟件對(duì)圖片進(jìn)行灰度值分析。結(jié)果以GAPDH作內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組SW620和LoVo細(xì)胞增殖能力比較 siRNA-TUG1組SW620和LoVo細(xì)胞中TUG1的表達(dá)水平較siRNA-NC組明顯下降(0.57±0.12 vs 1.03±0.17；0.43±0.08 vs 1.00±0.18)(P均<0.05)。siRNA-TUG1組轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h，SW620細(xì)胞增殖活性分別為0.20±0.01、0.24±0.06、0.46±0.06、0.66±0.07，LoVo細(xì)胞增殖活性分別為0.21±0.01、0.27±0.07、0.43±0.06、0.78±0.07。siRNA-NC組轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h，SW620細(xì)胞增殖活性分別為0.20±0.01、0.35±0.07、0.68±0.13、1.14±0.11，LoVo細(xì)胞增殖活性分別為0.20±0.01、0.37±0.08、0.71±0.13、1.16±0.11。轉(zhuǎn)染96 h，siRNA-TUG1組SW620和LoVo細(xì)胞的增殖活性較siRNA-NC組低(P均<0.05)。

2.2 各組SW620和LoVo細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 siRNA- TUG1組SW620和LoVo細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(53±5)、(61±3)個(gè)/HP，遷移細(xì)胞數(shù)分別為(84±10)、(102±8)個(gè)/HP；siRNA-NC組SW620和LoVo細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(93±6)、(99±8)個(gè)/HP，遷移細(xì)胞數(shù)分別為(165±11)、(185±15)個(gè)/HP。siRNA-TUG1組SW620和LoVo細(xì)胞的侵襲、遷移能力較siRNA-NC組下降(P均<0.05)。

2.3 各組SW620和LoVo細(xì)胞周期分布和凋亡率 siRNA-TUG1組G0/G1、M、S期SW620細(xì)胞比例分別為55.10%±3.64%、8.72%±2.20%、22.53%±1.99%，G0/G1、M、S期LoVo細(xì)胞比例分別為57.60%±3.96%、9.15%±1.95%、21.53%±2.25%；siRNA-NC組 G0/G1、M、S期SW620細(xì)胞比例分別為39.12%±2.50%、8.90%±2.00%、40.53%±2.70%，G0/G1、M、S期LoVo細(xì)胞比例分別為35.30%±2.94%、8.90%±1.80%、37.54%±2.74%。siRNA-TUG1組G0/G1期SW620和LoVo細(xì)胞比例高于siRNA-NC組(P均<0.05)，S期細(xì)胞比例低于siRNA-NC組(P均<0.05)。siRNA-TUG1組SW620細(xì)胞、LoVo細(xì)胞凋亡率分別為13.64%±1.56%、19.46%±2.41%，siRNA-NC組分別為5.93%±0.55%、7.47%±1.10%，兩組各細(xì)胞凋亡率比較，P均<0.05。

2.4 各組SW620和LoVo細(xì)胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 siRNA-TUG1組SW620細(xì)胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.49±0.05、0.37±0.04、0.25±0.02，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.51±0.05、0.39±0.04、0.29±0.03；LoVo細(xì)胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.64±0.07、0.47±0.05、0.38±0.04，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.62±0.06、0.51±0.05、0.43±0.04。siRNA-NC組SW620細(xì)胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.87±0.08、0.78±0.07、0.59±0.05，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.09、0.87±0.09、0.68±0.07；LoVo細(xì)胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.88±0.09、0.79±0.08、0.68±0.07，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.96±0.09、0.83±0.08、0.74±0.07。siRNA-TUG1組SW620和LoV細(xì)胞TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)低于siRNA-NC組(P均<0.05)。

3 討論

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤的第3位，近年隨著國(guó)人生活水平的提高、飲食習(xí)慣的改變、人口的老齡化以及結(jié)直腸癌普查的開(kāi)展，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人們的健康和生活質(zhì)量[10]。

LncRNAs是腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)新的成員，研究表明其在腫瘤的發(fā)生和腫瘤的抑制通路中發(fā)揮著重要作用[11]。在結(jié)直腸癌中存在多種LncRNAs的異常表達(dá)，包括HOTAIR、PVT1、SNHG1和AB073614等[12～15]。最近有研究顯示，在結(jié)直腸癌中TUG1存在明顯高表達(dá)，不僅影響患者預(yù)后還對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化具有重要作用[16]。本研究結(jié)果顯示，TUG1在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、HCT-116、SW620和LoVo中的表達(dá)水平高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC，說(shuō)明結(jié)直腸癌細(xì)胞TUG1表達(dá)升高。進(jìn)一步采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TUG1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的影響，采用siRNA-TUG1轉(zhuǎn)染SW620和LoVo細(xì)胞，TUG1在細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯下降;同時(shí)低表達(dá)TUG1可以明顯抑制SW620和LoVo細(xì)胞增殖活性，侵襲和遷移能力。說(shuō)明低表達(dá)TUG1可以抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展。在腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞的凋亡率明顯下降，因此促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡是抑制腫瘤進(jìn)展的重要方式。有研究[17]顯示，抑制TUG1表達(dá)后，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在本研究中低表達(dá)TUG1后SW620和LoV細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，S期細(xì)胞比例明顯下降，同時(shí)細(xì)胞凋亡率增加，說(shuō)明TUG1可以將結(jié)直腸癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。

TGF-β在依賴(lài)Smads的信號(hào)通路中，能夠誘導(dǎo)Smad2、α-SMA、Snail、HMGA2、Twist和ZEB等多種分子的表達(dá)[18]。HMGA2作為細(xì)胞核蛋白，不僅能夠與細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合，還能調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，其可以上調(diào)鋅指蛋白Snail和螺旋蛋白Twist的表達(dá)，Snail又能促進(jìn)Slug和Twist的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用及調(diào)控下，能夠使細(xì)胞上皮的程序化表達(dá)抑制，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的程序化表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。有研究[20]顯示，在慢性阻塞性肺疾病中TUG1能夠通過(guò)調(diào)控TGF-β信號(hào)通路影響疾病的進(jìn)展。另有研究顯示，TGF-β信號(hào)通路在腫瘤的進(jìn)展中具有重要作用。本研究中采用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)TGF-β、Smad2、α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示SW620和LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-TUG1后，TGF-β、Smad2和 α-SMA mRNA和蛋白的表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染siRNA-NC的細(xì)胞明顯降低，說(shuō)明TUG1低表達(dá)能夠抑制TGF-β信號(hào)通路。

綜上所述，TUG1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中明顯高表達(dá)，干擾TUG1表達(dá)可能通過(guò)抑制TGF-β信號(hào)通路激活抑制結(jié)直腸細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。TUG1有可能成為結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床，這需要進(jìn)一步研究探討。