楊彪，劉克，李世超，謝洋，梁春雨

(華北理工大學附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000)

在過去的幾十年里，細胞和分子生物學的發(fā)展以及創(chuàng)面愈合和組織再生過程的科學進步，促進了新型多學科領域的研究和發(fā)展，如再生醫(yī)學和組織工程。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)的出現(xiàn)和應用使再生醫(yī)學領域發(fā)生了革命性的變化，PRP是一種用于刺激和加速組織愈合的新型生物技術，其生物學效應主要歸因于其中的血小板分泌體和血漿信號蛋白等成分，PRP可在不同的病理微環(huán)境下，通過不同的再生機制，包括止血，炎癥，血管生成和細胞外基質的合成等促進創(chuàng)面愈合，縮短創(chuàng)面愈合的時間，此外PRP還能減輕水腫、瘢痕和疼痛，降低感染率[1]，間接地降低截肢率，提高患者的生活質量，減少醫(yī)療費用支出。這種方法的多功能性和生物相容性及其簡易的制備方案促進了它在許多醫(yī)學領域的應用，包括骨科、牙周、口腔外科、頜面外科、心臟外科、整形外科、運動醫(yī)學等學科。本文旨在對PRP在慢性難愈性創(chuàng)面的研究進展做一綜述。

1 PRP的特性

1.1 PRP中血小板的作用 血小板來源于巨核細胞，沒有細胞核，包含有3種類型的血小板顆粒：α顆粒、致密體和溶酶體[2]。α顆粒是最大的細胞器，每個血小板大約有50～80個α顆粒，α顆粒直徑約200～500 nm，包含30多種生物活性蛋白，其中許多在止血和/或組織愈合中起著重要作用。α顆粒存儲有黏附蛋白、趨化因子、細胞因子和生長因子等多種生物活性物質。最近的研究表明，促血管生成和抗血管生成因子可能存在于不同的顆粒亞型中，因此可以調節(jié)傷口愈合炎癥后期相關的血管生成過程。致密顆粒所攜帶的生物活性因子如三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、血清素、5-羥色胺、多巴胺、組胺、腺苷和鈣等用于組織恢復過程。致密體顆粒分泌物缺失將影響機體恢復組織完整性的能力。溶酶體中含有與蛋白質、碳水化合物及脂質降解有關的多種酶類，盡管它們的功能尚未充分探索，但可以肯定的是它們在吞噬和消化胞質成分、受體的分裂、纖溶、細胞外基質成分的降解和重構以及血管系統(tǒng)的調節(jié)中發(fā)揮著重要作用[3]。

血小板活化后，除了發(fā)揮止血功能外，在炎癥和組織再生中發(fā)揮著重要的作用。其通過釋放生長因子、細胞因子、趨化因子和細胞外基質調節(jié)劑等生物活性物質來介導傷口愈合的每一個階段。生物活性物質與不同細胞跨膜受體結合后，引發(fā)細胞內信號，最終影響核基因的表達，依次為組織愈合奠定了基礎。血小板含有纖維連接蛋白、玻連蛋白和層粘連蛋白，血小板因子、5-羥色胺、基質金屬蛋白酶及其組織抑制劑的共同作用誘導了細胞外基質的生成和重塑；除了基質合成作用外，血小板可誘導間充質干細胞向組織特異性細胞類型的增殖和分化[3]。

血小板也是一種多功能的宿主防御細胞，表達多種蛋白和受體，包括Fc、補體和Nf-MLF受體，以及抗菌肽，有助于協(xié)調對細菌的免疫防御，血小板與微生物直接相互作用，有助于清除血液中的病原體。除了免疫調節(jié)作用外，血小板也直接影響宿主防御效應細胞的作用。血小板作為止血免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，在不同的感染中發(fā)揮著不同的作用。血小板被激活后可以吸收中性粒細胞，清除革蘭氏陰性細菌(即它們是調制器)，也可通過擴大炎性細胞的數(shù)量幫助轉移革蘭氏陽性菌(即它們是轉運體)[4]。最近的研究表明，血小板可以將促炎性巨噬細胞重新極化成修復型，血小板與巨噬細胞在炎癥或組織修復損傷過程中的這種聯(lián)系的發(fā)現(xiàn)，可能有助于治療慢性炎癥相關疾病的治療策略進一步開發(fā)[5]。

1.2 PRP中白細胞及其他抗菌活性物質 白細胞在傷口愈合過程中起著關鍵作用。第一個遷移到傷口部位的白細胞是中性粒細胞。它們的主要作用是吞噬碎片、微生物和壞死組織，以清潔傷口和防止感染，激活后的中性粒細胞可產(chǎn)生一系列炎性介質，引起炎癥級聯(lián)反應。單核細胞是在傷口部位招募的第二種白細胞，它們成熟為巨噬細胞，并成為主要的細胞類型。巨噬細胞吞噬死亡的中性粒細胞，進一步清除組織碎片。巨噬細胞的其他關鍵作用包括釋放生長因子和細胞因子、并招募其他細胞類型和刺激血管生成。除了生長因子，白細胞可表達多種蛋白酶，如絲氨酸和金屬蛋白酶，它們在傷口愈合中起關鍵作用。因此白細胞在PRP中的存在可能促進修復過程。

PRP的抗菌機制尚未完全確定，目前已明確血小板具有宿主防御效應細胞的結構和功能，激活后的血小板顆?？舍尫哦喾N生物活性物質，包括趨化因子、協(xié)同刺激分子和抗菌肽等參與炎癥反應。活化的血小板可與白細胞結合，刺激白細胞功能。血小板還可以合成蛋白質，包括促炎性細胞因子促炎性細胞因子1[6]。Yeaman等[7]從凝血酶誘導血小板的釋放物中提取并鑒定了抗菌多肽，發(fā)現(xiàn)血小板宿主防御機制是通過釋放多種血小板殺菌劑蛋白發(fā)揮作用。Tang等[8]報道了人類血小板激活后可釋放7種抗菌肽：血小板因子4、RANTES、激活肽3、血小板基礎蛋白-4、纖維蛋白肽B、纖維蛋白肽A、血小板堿性蛋白。他們在體外測試了這些肽對大腸桿菌、葡萄球菌和金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和新生隱球菌的抗菌活性。發(fā)現(xiàn)它們對細菌的抗菌活性比真菌強，而且抗菌活性是劑量依賴性，并且酸性的pH值可以增強血小板抗菌肽的直接殺菌能力。有學者研究了PRP的體外抗菌活性，發(fā)現(xiàn)PRP凝膠抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長，但對肺炎克雷布菌、糞腸球菌或銅綠假單胞菌均無活性。此外，PRP可能誘導銅綠假單胞菌的生長，提示它可能會導致該生物的感染加劇。Cetinkaya等[9]研究自體PRP對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、ESBL陽性肺炎克雷伯菌和碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌的體外抗菌活性進行比較，發(fā)現(xiàn)其對三種耐藥菌均具有抗菌活性，但對耐萬古霉素腸球菌VRE無明顯影響。PRP可顯著降低炎癥反應，并在MRSA感染的基礎上實現(xiàn)傷口愈合。

1.3 PRP中生長因子的作用 血小板的活化后，α顆粒通過脫粒形式釋放生長因子。大約70%的生長因子在10 min內被釋放，幾乎100%的生長因子在1 h內被釋放。在其約為7 d的生命周期中，血小板可繼續(xù)合成并分泌少量的生長因子。生長因子在創(chuàng)傷愈合和組織再生的復雜過程中起著至關重要的作用。它們是影響其他細胞新陳代謝的信號蛋白，通過與靶細胞細胞膜上的特異性受體結合而起作用，它們?yōu)榻M織愈合奠定了基礎。目前已知涉及傷口愈合過程中主要的生長因子包括：它們?yōu)榻M織愈合奠定了基礎。目前已知涉及傷口愈合過程中主要的生長因子包括：血小板源生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)、胰島素樣生長因子(insulin growth factor，IGF)-1，IGF-2、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)[10]，它們在傷口愈合過程中的作用描述如下。

PDGF是損傷后分泌的第一個生長因子，PDGF有5個亞型(AA、AB、BB、CC、DD)，每一種PDGF亞型都被證實在傷口愈合中誘導血管生成和基質合成以及細胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。PDGF刺激許多代謝過程，如PDGF刺激嗜中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞的有絲分裂和趨化性，促進炎癥反應的啟動。刺激這些細胞產(chǎn)生蛋白聚糖、透明質酸、纖維連接蛋白；它也促進內皮細胞的增殖和遷移，從而發(fā)揮血管生成效果；合成和分泌TGF-β，啟動膠原蛋白的合成；激活巨噬細胞產(chǎn)生更多的生長因子，并幫助清除受損組織。PDGF在血管成熟過程中尤為重要，增加血管的結構完整性。在傷口愈合的上皮化階段，PDGF上調IGF-1和血小板反應蛋白-1的生成。在組織重塑過程中，PDGF通過上調基質金屬蛋白酶來幫助破壞舊的膠原蛋白，重塑細胞外基質[11-16]。

VEGF的中心作用是通過調節(jié)內皮細胞的增殖和遷移來刺激血管生成，成為啟動肉芽組織血管生成過程的主要反應生長因子。VEGF也與FGF協(xié)同作用，以刺激血管生成。除了血管生成作用外，VEGF在傷口愈合過程中也起到了淋巴管生成的作用[11]。

TGF-β三種不同的亞型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3[11，12]。TGF-β1可作為中性粒細胞、巨噬細胞和成纖維細胞的趨化劑，通過增加與ECM形成相關的基因的表達，包括纖連蛋白、纖連蛋白受體、膠原蛋白和蛋白酶抑制劑，幫助啟動肉芽組織形成，它還參與上調血管生成因子VEGF。TGF-β1的作用與劑量相關，例如：它在低濃度時增強成纖維細胞增殖，但在高濃度時誘導分化。此外，體外研究表明TGF-β1和TGF-β2與瘢痕和纖維化有關，它們促進成纖維細胞分化，細胞外基質沉積，傷口收縮，瘢痕形成，在傷口收縮過程中發(fā)揮作用。同時也是金屬蛋白酶MMP-1、MMP-3和MMP-9的有效抑制劑。TGF-β3也與血管生成相關。

在成纖維細胞生長因子家族(FGF)中，F(xiàn)GF-2、FGF-7和FGF-10被證明是傷口愈合的重要組成部分。FGF對上皮形成、血管生成、肉芽組織形成和組織重塑中有促進作用。FGF是內皮細胞的有絲分裂原，通過內皮細胞的增殖刺激新血管的生長，起到血管生成因子的作用。FGF-2通過刺激毛細血管內皮細胞的浸潤和增殖，增加肉芽組織中的血管生成參與啟動肉芽組織形成，從而縮短愈合時間，增加傷口強度，其可調控多種細胞外基質成分的合成和沉積。FGF-7和FGF-10通過刺激角質形成細胞的增殖和遷移在再上皮化中起著重要的作用。此外，F(xiàn)GF-7有助于VEGF的上調，它還刺激內皮細胞產(chǎn)生尿激酶型纖溶酶原激活劑，在血管形成后期起重要作用[11，13]。

EGF影響組織修復中的兩個關鍵作用：細胞增殖和細胞凋亡。通過刺激成纖維細胞、角質形成細胞、血管內皮、平滑肌細胞和上皮細胞來增加傷口愈合。EGF加速了再上皮化，可通過增加創(chuàng)面中成纖維細胞的數(shù)量增加傷口的抗拉強度。在慢性創(chuàng)傷的臨床試驗中，局部EGF治療增加了上皮化和縮短愈合時間[10]。

KGF誘導角質形成細胞的增殖和遷移，主要在愈合重構階段發(fā)揮作用。重組人KGF-2用于治療靜脈潰瘍顯示了它們可增強上皮細胞的增殖[12]。

IGF主要參與炎癥和增殖階段。IGF-1已經(jīng)被證明可以增加角質細胞的活力，保護PDGF蛋白以避免降解，并以劑量依賴性的方式促進纖維細胞的生長[14]。

HGF這種生長因子由間充質細胞分泌，在上皮細胞和內皮細胞等細胞中起調節(jié)細胞生長、運動和形態(tài)變化等作用。因此，它直接與上皮修復、肉芽組織形成和血管生成有關，并且與VEGF有協(xié)同作用[13]。

2 PRP的制備及激活

Ehrenfest等人針對PRP產(chǎn)品的主要細胞和分子成分，提出根據(jù)白細胞和纖維蛋白含量將PRP產(chǎn)品分為四大類：富白細胞-血小板血漿(L-PRP)、純富血小板血漿(P-PRP)、富白細胞-血小板的纖維蛋白(L-PRF)和純富血小板纖維蛋白(P-PRF)。最近，有學者根據(jù)白細胞的存在與否(L或P)，纖維蛋白含量(高：PRF；低：PRP)，激活或不激活(I或II)，血小板濃度(A：900×103/μL；B：900×103/μL～1 700×103/μL；C：>1 700×103/μL)，以及制備類別(重力血小板封存技術；標準細胞分離器；自體選擇性過濾)，用數(shù)字和字母字符的組合，提出了更詳細的分類系統(tǒng)來區(qū)分PRP的類別，例如：L-PRPIB1。這種簡單、準確、實用的分類系統(tǒng)有助于去區(qū)別文獻中對PRP產(chǎn)品的混淆[15]。

目前尚無統(tǒng)一的制備標準，主要有血漿分離置換法和密度梯度離心法，其原理是根據(jù)全血中各種成分的沉降系數(shù)不同，通過不同的離心方法提取PRP，其影響因素包括不同的離心力、離心時間、離心次數(shù)、激活劑等。制備方法的不同，產(chǎn)品質量和最終的臨床療效也不同。目前多采用二次密度梯度離心法，第一次離心分離紅細胞，第二次離心分離貧血小板血漿(PPP)和富血小板血漿(PRP)。PRP制備完成后，其在抗凝狀態(tài)下穩(wěn)定保存8h或更長時間[16]。

血小板激活是研究PRP產(chǎn)品的一個重要標準。近年來，人們提出了不同的激活方案，如：牛凝血酶/凝血活酶、凝血酶受體激動劑肽、ITA膠凝劑、巴曲酶、CaCl2、抗壞血酸等[17]。最常見的激活方法是添加鈣/凝血酶混合劑，生成富血小板血漿凝膠。這種激活劑中鈣可抵消采血時添加的抗凝血劑，凝血酶除激活血小板外還可以使纖維蛋白原激活為纖維蛋白。PRP無法達到改善組織愈合的一個原因可能是凝血酶濃度較低或只添加凝血酶或CaCl2，因為這些激活方法不會導致血小板生長因子的完全激活和釋放。然而，不同來源和方法獲得的凝血酶會干擾PRP的治療效果。牛凝血酶可能出現(xiàn)出血、血栓形成、免疫反應等不良反應。為避免這些不良并發(fā)癥，自體凝血酶應被優(yōu)先使用。自體凝血酶可從血清樣本中獲得，也可通過T-PRP獲得。有研究比較了自體凝血酶獲取的方法，發(fā)現(xiàn)自體血清制備凝血酶有制備更容易、速度更快，避免使用部分PRP等優(yōu)勢[18]。不同激活劑對PRP的性狀、生物活性物質的產(chǎn)生及療效影響不同。有研究比較了葡萄糖酸鈣和凝血酶激活PRP后，凝膠形成、生長因子含量及微囊泡濃度變化，得出結論：葡萄糖酸鈣緩慢激活PRP，形成的PRP凝膠回縮緩慢，并且釋放高含量的bFGF和高濃度的微囊泡，宜于修復關節(jié)腔及竇道性創(chuàng)面；凝血酶快速激活PRP，形成的PRP凝膠回縮較快，釋放高含量的PDGF-BB和一定濃度的微囊泡，宜于修復急性創(chuàng)傷[19]。

血小板計數(shù)與生長因子濃度之間的確切關系尚不清楚。有作者認為隨著血小板數(shù)量的增加，生長因子的濃度也隨之增加。一些研究表明，血小板計數(shù)與PRP激活后釋放的生長因子的類型和數(shù)量有關，例如，Sundman等人研究發(fā)現(xiàn)血小板計數(shù)與TGF-1之間存在正相關關系。也有作者認為，血小板濃度與生長因子濃度成正相關的假設是錯誤的[20]。

目前在PRP中加入白細胞仍存在分歧。雖然有大量的文獻詳細描述了血小板的傷口愈合和抗菌性能，但在PRP制劑中包含白細胞的問題多年來一直被忽視。盡管白細胞在組織修復和宿主防御中所起的作用得到了廣泛的認可，但PRP中所包含的白細胞的潛在作用尚未得到充分的探索。一些作者認為，加入白細胞有助于提高纖維蛋白支架的穩(wěn)定性，同時增加抗菌潛力。但是也有研究表明，額外的白細胞并不能顯著改善PRP的抗菌性能，另外，由于白細胞可分泌金屬蛋白酶，以及白細胞中含有的促炎蛋白酶和酸性水解酶，額外的白細胞可能會增加該部位的炎癥反應[21]。

3 PRP在慢性難愈性創(chuàng)面中的應用

目前對于慢性難愈性創(chuàng)面的具體定義尚未達成共識，國際創(chuàng)傷愈合學會定義慢性難愈性創(chuàng)面為：無法通過正常、有序、及時的修復過程而造成；或者是經(jīng)過修復而沒有恢復解剖和功能上完整狀態(tài)的傷口。有學者認為，經(jīng)過30 d的標準治療后，沒有完全愈合的創(chuàng)面是慢性難愈性的；有學者則認為如果在6周內沒有達到完全愈合，或者沒有觀察到對治療有積極反應，那么創(chuàng)面可被定義為慢性難愈性；也有學者認為在3個月內不愈合的創(chuàng)面為慢性難愈性創(chuàng)面[22]。

正常的傷口愈合是一種動態(tài)協(xié)調的組織修復過程，包括凝血、炎癥、基質合成、血管生成、纖維增生、上皮化、傷口收縮和重塑。涉及多種細胞類型、生長因子、細胞因子和趨化因子的相互作用，分為四個階段：止血、炎癥、組織形成和組織重塑。然而，由于不同的病因，如慢性靜脈疾病、外周動脈疾病、神經(jīng)病變、動脈高壓、物理創(chuàng)傷、血液病、皮膚感染、炎性疾病、腫瘤、營養(yǎng)和醫(yī)源性改變等，正常的愈合過程被中斷，導致慢性炎癥階段的持續(xù)阻滯，就會出現(xiàn)慢性難愈性創(chuàng)面。表現(xiàn)為持續(xù)高水平的基質金屬蛋白酶和促炎細胞因子和持續(xù)低水平的金屬蛋白酶組織抑制劑和生長因子。低氧和重復的感染促進了過量的蛋白水解酶和隨之而來的生長因子和纖維蛋白的缺失，阻滯了傷口的愈合[23]。PRP介導病變治愈的關鍵作用機制就是調節(jié)持續(xù)的炎癥階段。在炎性病變背景下，PRP通過分泌生長因子、細胞因子、趨化因子等炎性介質以及趨化因子受體的表達發(fā)揮作用。為了消除炎癥，富集的活化血小板表現(xiàn)出良好的促炎因子和抗炎因子的平衡能力。PRP能夠調節(jié)損傷部位的主要炎癥細胞(如中性粒細胞和巨噬細胞)的分泌和招募，可以重新啟動愈合過程，將傷口從炎癥循環(huán)轉移到愈合的增殖階段。

許多研究表明PRP是促進慢性難愈性創(chuàng)面愈合安全有效的方法。在對慢性難愈性傷口研究的Meta分析中，Carter等[24]證實PRP治療可以積極影響創(chuàng)傷愈合和相關因素，如慢性皮膚創(chuàng)傷的疼痛和感染等因素。Ahmed等把56名慢性糖尿病足潰瘍患者，隨機分成兩組，實驗組使用PRP治療，對照組使用抗菌藥膏敷料治療，每周應用2次，結果表明PRP組創(chuàng)面愈合率達86%，對照組為68%，并且與對照組對比創(chuàng)面感染率明顯降低[25]。Babaei等[26]觀察了150例糖尿病足潰瘍患者，皮下注射自體PRP及PRP凝膠局部應用4周后，所有患者的傷口面積均減小，并最終痊愈，經(jīng)過8個月的隨訪無一例復發(fā)。Afradi等[27]使用PRP治療100例地中海貧血患者腿部潰瘍，治療4周后潰瘍面積開始縮小。面積為2.0～3.5 cm2的創(chuàng)面，12.5周后完全閉合；面積為3.5～4.5 cm2的創(chuàng)面，13.2周后完全閉合，4.5～6.0 cm2的創(chuàng)面，14周后完全愈合。隨訪8個月無一例潰瘍復發(fā)。Suthar等[28]對符合納入標準的24例不同病因的慢性難愈性創(chuàng)面患者局部使用PRP，包括10例靜脈潰瘍，9例糖尿病潰瘍，3例動脈潰瘍和2例壓瘡。患者創(chuàng)面平均持續(xù)時間為16周，在使用PRP 4周后發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面肉芽組織生長，面積減小，平均愈合時間為(8.2±1.9)周，證實了自體PRP治療慢性非愈合潰瘍的安全性和有效性。Prabhu等[29]對104例不同原因引起的慢性難愈性潰瘍患者進行每周兩次同源PRP治療，潰瘍的平均面積為5.03 cm2。結果85例(81.73%)痊愈，13例(12.5%)進行二次植皮手術愈合。

PRP除了作為一種治療創(chuàng)面的單一療法外，在與其他療法(如NPWT、脂肪源性干細胞ASCs)聯(lián)合使用也表現(xiàn)出顯著療效。Raposio等在一項為期18個月的隨機對照試驗中，對照組24例患者31個創(chuàng)面，實驗組16例患者21個創(chuàng)面，實驗組患者在對照組治療基礎條件上聯(lián)合使用了PRP+ASCs，結果表明聯(lián)合使用PRP+ASCs后創(chuàng)面愈合速度明顯增加，并且無不良并發(fā)癥發(fā)生[30]。有研究聯(lián)合使用PRP和封閉負壓引流技術對44例老年骨外露創(chuàng)面患者治療，結果表明聯(lián)合使用組術后7、14 d創(chuàng)面肉芽組織覆蓋率顯著高于單純應用VSD組，并且創(chuàng)面愈合時間、術后14 d VAS疼痛評分及6個月瘢痕評分也低于VSD組[31]。也有研究比較了PRP聯(lián)合VSD與單純VSD治療46例糖尿病足潰瘍的療效。PRP+VSD組先行VSD治療，然后使用自體PRP外敷創(chuàng)面，后再行VSD治療；VSD組患者的創(chuàng)面持續(xù)行VSD治療。結果表明治療2個周期后PRP+VSD組創(chuàng)面愈合率為95.65%，明顯高于VSD組47.83%，兩組的治療有效率分別為100.00%、86.96%，并且聯(lián)合組創(chuàng)面愈合時間明顯短于對照組[32]。

4 小 結

富血小板血漿具有刺激和加速組織愈合的潛力，其療效在體外和體內都得到了證實，由于PRP是一種自體生物材料，它消除了免疫反應和疾病傳播的風險，可望成為治療慢性難愈性創(chuàng)面的一種高效的替代療法。然而，關于PRP的生物學機制仍有待進一步突破，需要進行大量的基礎科學研究和臨床試驗研究，進一步明確PRP應用的最佳濃度、最佳時機和最佳的生理環(huán)境，制定出PRP制備及應用的統(tǒng)一標準，以便更好地在臨床上推廣應用。