周文 王佳麗 譚碧波 莫凌昭

宮頸癌是我國女性第二大常見惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢［1-2］。手術(shù)是宮頸癌最主要的治療方法，但對于存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)切緣陽性等復(fù)發(fā)高危因素的患者，化療是重要的輔助治療手段。宮頸癌具有高度異質(zhì)性，同一化療方案不同患者療效不盡相同，而腫瘤細胞耐藥或不敏感是化療失敗的主要原因［3-4］。因此，尋找化療敏感及耐藥靶點，對選擇化療方案，改善預(yù)后尤為關(guān)鍵。核苷酸切除修復(fù)交叉互補基因1（nucleotide excision repair cross complementary gene1，ERCC1）和核苷酸還原酶M1（nucleotide reductase M1，RRM1）為化療耐藥基因［5］，而胸苷酸合成酶基因（thymidine synthase gene，TYMS）與化療療效密切相關(guān)［6］。本研究通過檢測與宮頸癌預(yù)后密切相關(guān)的ERCC1、TYMS、RRM1在宮頸癌組織中的表達，并分析其與患者臨床病理特征及化療療效的關(guān)系，以期為化療療效和預(yù)后評估尋找新的靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2016年1月至2016年12月于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診的宮頸癌患者術(shù)后標(biāo)本33例。所有患者術(shù)前均未接受手術(shù)或放化療治療，術(shù)后采取以鉑類為主的化療方案，臨床病理及隨訪資料完整。本研究已通過本院倫理委員會審批，患者及家屬知情同意并簽署同意書。

1.2 治療方法

化療前所有患者均行婦科體格、血常規(guī)以及生化常規(guī)等檢查，無化療禁忌證。所有患者均采用以鉑類為主的化療方案。順鉑70 mg/m2，靜脈滴注；吉西他濱1 g/m2，靜脈滴注，d1、8，21 d 為 1 個周期，4～5 個周期。常規(guī)給予護肝、護胃、抗過敏、止吐等對癥支持治療。

1.3 RT-PCR法檢測ERCC1、TYMS及RRM1 mRNA的表達

4%～10%中性福爾馬林溶液固定標(biāo)本，由廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司檢測ERCC1、TYMS和RRM1 mRNA表達水平。按照AmoyDx FFPE樣品RNA分離試劑盒說明書提取總RNA，測定RNA的純度及含量，再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin為內(nèi)參，進行實時熒光定量PCR檢測。PCR反應(yīng)：94℃5 min，1個循環(huán)；94℃15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，10 個循環(huán)；94 ℃ 15 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 15 s，30 個循環(huán)。2-△△Ct法計算 ERCC1、TYMS和RRM1 mRNA的表達量。實驗重復(fù)3次。根據(jù)基因檢測結(jié)果，分別將ERCC1、TYMS和RRM1 mRNA表達量超過 3.04×10-3、2.71×10-3、10.10×10-3記為陽性表達，表達量低于 3.04×10-3、2.71×10-3、10.10×10-3記為陰性表達。

1.4 隨訪及療效評價

通過再次入院、門診復(fù)查、電話等隨訪方式隨訪，每3個月進行1次隨訪，隨訪截至2019年3月。中位隨訪時間32個月，平均30個月。總生存期定義為確診至患者死亡、失訪或隨訪截止的時間?；熃Y(jié)束后依據(jù)WHO實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)評價療效，分為完全緩解（CR）：腫瘤完全消失，超過1個月；部分緩解（PR）：腫瘤最大直徑及最大垂直直徑的乘積縮小達50%，其他病變未增大，持續(xù)超過1個月；疾病穩(wěn)定（SD）：病變兩徑乘積縮小不超過50%，增大不超過25%，持續(xù)超過1個月；疾病進展（PD）：病變兩徑乘積增大超過25%?？傆行?［（CR+PR）/總例數(shù)］×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用獨立樣本t檢驗分析ERCC1、TYMS和RRM1 mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系；采用χ2檢驗比較3個基因表達與宮頸癌化療療效的關(guān)系；采用Pearson相關(guān)分析3個基因在宮頸癌組織中表達的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier法計算生存率，組間比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERCC1、TYMS及RRM1 mRNA表達及與臨床病理特征的關(guān)系

33例宮頸癌組織中ERCC1、TYMS、RRM1陽性表達率分別為 78.8%（26/33）、69.7%（23/33）、75.8%（25/33）。ERCC1表達與FIGO分期、腫瘤大小、高危型HPV病毒感染、淋巴脈管癌栓、肌層浸潤深度及鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）水平有關(guān)（P<0.05）；TYMS表達與腫瘤大小、高危型HPV病毒感染及淋巴脈管癌栓有關(guān)（P<0.05）；RRM1表達與各項臨床病理特征均無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表 1 ERCC1、TYMS、RRM1 表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s，×10-3）Tab.1 Relationship between ERCC1，TYMS，RRM1 expression and clinicopathological features of cervical cancer patients（±s，×10-3）

表 1 ERCC1、TYMS、RRM1 表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s，×10-3）Tab.1 Relationship between ERCC1，TYMS，RRM1 expression and clinicopathological features of cervical cancer patients（±s，×10-3）

Characteristics n ERCC1 TYMS RRM1 Expression t P Expression t P Expression t P Age(year) 0.543 0.591 0.041 0.968 1.501 0.143＜50 20 7.59±4.97 9.36±6.37 39.31±24.79≥50 13 6.69±4.13 9.26±7.87 28.08±12.89 Nationality -1.227 0.229 -0.065 0.949 -0.876 0.388 Han nationality 21 6.50±3.51 9.26±7.00 32.40±18.97 Ethnic minority 12 8.53±6.05 9.43±6.95 39.22±25.42 Menopause 0.627 0.535 -0.250 0.804 1.020 0.316 Yes 14 6.80±3.97 9.58±7.21 31.62±21.76 No 19 7.83±5.47 8.97±6.65 39.31±20.87 FIGO stage -2.113 0.043 -1.788 0.083 -0.019 0.985Ⅰ-Ⅱ 30 6.69±4.61 8.61±6.69 36.14±22.63Ⅲ-Ⅳ 3 11.65±1.34 15.77±5.20 36.40±13.27 Degree of differentiation 1.496 0.145 0.044 0.965 0.285 0.778 Poorly differentiated 23 8.01±5.14 9.36±7.22 35.59±24.79 Well differentiated 10 5.45±2.43 9.24±6.38 33.25±11.09 Pathological type 0.953 0.348 1.044 0.304 -0.506 0.616 Squamous cell carcinoma 24 7.70±5.01 10.09±6.90 33.71±20.70 Non squamous cell carcinoma 9 5.98±3.26 7.28±6.77 38.00±24.19 Tumor size（cm) 0.113 <0.001 -2.859 0.008 0.399 0.693≤4 14 3.99±2.40 5.72±6.13 36.64±27.86>4 19 9.63±4.41 11.98±6.27 33.59±15.80 Depth of invasion -2.157 0.039 -0.030 0.976 0.551 0.586≤1/2 10 4.75±2.62 9.27±6.64 38.03±18.81>1/2 23 8.32±4.91 9.35±7.12 33.51±22.70 High risk HPV -2.838 0.008 -2.512 0.017 0.819 0.419 Positive 12 8.80±4.43 11.43±6.78 32.56±14.57 Negative 21 4.51±3.66 5.64±5.55 38.94±30.32 Lymph nodes metastasis -0.223 0.825 -0.290 0.774 0.364 0.718 Yes 20 7.46±3.44 9.76±6.53 33.18±15.31 No 13 7.09±5.32 9.04±7.24 35.99±24.91 SCC-Ag(μg/L) -2.632 0.013 -0.505 0.617 -0.137 0.892≤1.5 21 5.77±3.28 8.86±7.62 34.50±23.36>1.5 12 9.80±5.57 10.13±5.55 35.57±18.44 Cancer thrombus of lymphatic vessel -2.457 0.020 -2.478 0.019 -1.256 0.218 Yes 15 8.91±4.83 11.84±6.80 39.12±22.37 No 18 5.23±3.52 6.31±5.84 29.80±19.72

2.2 宮頸癌組織中ERCC1與TYMS、RRM1表達的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，ERCC1 mRNA表達水平與TYMS mRNA 表達水平呈正相關(guān)（r=0.608，P=0.004），與RRM1 mRNA表達水平無相關(guān)性（r=0.418，P=0.152）。見表2。

2.3 ERCC1、TYMS、RRM1與宮頸癌患者化療療效的關(guān)系

33例患者均完成化療計劃，可評估療效。ERCC1、TYMS、RRM1陽性表達組患者總有效率分別為46.2%、34.8%、44.0%，均低于陰性表達組患者的85.7%、90.0%、87.5%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 ERCC1、TYMS、RRM1表達水平與宮頸癌患者化療療效的關(guān)系［n（%）］Tab.3 Relationship between the expression of ERCC1，TYMS and RRM1 and the efficacy of chemotherapy in cervical cancer patients［n（%）］

2.4 ERCC1、TYMS、RRM1表達的總生存期的關(guān)系

ERCC1、TYMS、RRM1陽性表達患者3年總生存率分別為61.5%、60.9%、56.0%，均低于陰性表達患者的 100.0%、90.0%、100.0%，但 ERCC1、TYMS、RRM1陰性表達的患者的生存曲線與陽性患者比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.404，P=0.236；χ2=0.263，P=0.608；χ2=0.236，P=0.627）。

3 討論

鉑類藥物是目前治療宮頸癌的一線化療藥物［7］。研究發(fā)現(xiàn)鉑類藥物通過與DNA結(jié)合形成Pt-DNA加合物，影響DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，從而造成腫瘤細胞的DNA損傷及細胞凋亡［8］。ERCC1是核苷酸切除修復(fù)途徑的重要組成部分，可直接影響DNA修復(fù)的生理過程［9］。研究發(fā)現(xiàn)，ERCC1參與鉑類藥物耐藥的發(fā)生，其表達水平與鉑類藥物化療療效及總生存期呈負相關(guān)［10-11］。TYMS是一種葉酸依賴性酶，其編碼的胸苷酸合成酶是嘧啶核苷酸合成限速酶，也是5-FU發(fā)揮細胞毒作用的目標(biāo)酶［12］。RRM1是DNA合成與修復(fù)的限速酶，也是導(dǎo)致吉西他濱耐藥的關(guān)鍵靶點［13-14］。本研究檢測33例宮頸癌組織中ERCC1、TYMS、RRM1的表達，發(fā)現(xiàn)三者陽性表達率依次為78.8%、69.7%、75.8%，且高表達ERCC1和TYMS的宮頸癌患者與不良臨床病理特征有關(guān)，其中兩者均高表達患者腫瘤直徑更大、感染高危型HPV病毒且有淋巴脈管癌栓，ERCC1高表達患者還與更晚的FIGO分期、更嚴(yán)重的肌層浸潤深度、更高的SCC-Ag水平有關(guān)，Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)ERCC1與TYMS mRNA表達水平呈正相關(guān)。ZHU等［15］研究亦發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中ERCC1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。鄭巧榮等［16］報道TYMS表達與宮頸癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。說明ERCC1和TYMS高表達的宮頸癌細胞浸潤性更強，惡性程度更高，且可能在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用。本研究未發(fā)現(xiàn)RRM1表達與臨床病理特征的相關(guān)性，但付娟等［17］研究顯示RRM1表達與局部晚期宮頸癌患者分化程度、盆腔淋巴結(jié)腫大有關(guān)，可能與納入對象疾病程度及治療方案等不同有關(guān)。

本研究根據(jù)ERCC1、TYMS、RRM1表達分為陽性表達和陰性表達組，兩組患者均接受4～5個周期的以鉑類藥物為主的化療，進一步觀察其近期和遠期療效，發(fā)現(xiàn)三者陽性表達的患者化療總有效率均低于陰性表達患者，3年總生存率亦均低于陰性表達患者，但是總體生存未見統(tǒng)計學(xué)差異。DU等［18］研究亦發(fā)現(xiàn)ERCC1表達水平與非小細胞肺癌患者鉑類藥物化療療效及總生存期呈負相關(guān)。而RRM1低表達患者吉西他濱治療療效更顯著［19］。分析原因可能是核苷酸修復(fù)系統(tǒng)在鉑類耐藥中起重要作用，而ERCC1為核苷酸切除修復(fù)途徑的關(guān)鍵基因，其高表達可增強腫瘤細胞DNA損傷后的修復(fù)能力，致使鉑類化療藥物耐藥。吉西他濱主要通過阻斷DNA的合成發(fā)揮抗癌作用，而RRM1高表達會加速DNA的合成，減少腫瘤細胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細胞對吉西他濱產(chǎn)生耐藥。而TYMS表達增高會導(dǎo)致胸腺嘧啶核苷及嘌呤核苷合成增強，加速腫瘤細胞增殖。因此，三者高表達可能加強了宮頸癌患者對順鉑及吉西他濱耐藥，從而降低以鉑類為主化療方案的療效。

綜上所述，ERCC1、TYMS、RRM1 高表達的宮頸癌患者侵襲性及惡性程度更高，且三者可能參與宮頸癌患者鉑類藥物的耐藥反應(yīng)，導(dǎo)致術(shù)后化療療效欠佳。ERCC1、TYMS、RRM1有望成為化療療效的評估指標(biāo)，檢測其表達可能有助于預(yù)測化療藥物敏感性和制定化療方案，提高患者化療有效率，從而改善預(yù)后。但本研究樣本數(shù)量有限，且未排除手術(shù)、化療藥物劑量等對化療療效及總生存期的影響，有關(guān)結(jié)論尚需進一步研究證實。