劉洋 郭姍姍劉曼玲 李藝杰 賈永峰 郭旭

線粒體是幾乎存在于所有真核細(xì)胞中的重要細(xì)胞器，每個(gè)細(xì)胞都包含多個(gè)拷貝的線粒體基因組。有研究報(bào)道線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變引起的線粒體功能障礙與腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［1-2］。對(duì)肝癌患者全外顯子測(cè)序（whole exosome sequencing，WES）數(shù)據(jù)中的mtDNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了92個(gè)體細(xì)胞突變［3］。因線粒體占據(jù)了肝細(xì)胞胞質(zhì)體積的20%［4］，且在肝代謝中起重要作用，因此推測(cè)肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生可能與mtDNA突變密切相關(guān)。目前傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)癌癥的體細(xì)胞mtDNA突變［5-10］，但操作復(fù)雜，檢測(cè)靈敏度低，臨床應(yīng)用受限。本研究利用全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）技術(shù)檢測(cè)mtDNA拷貝數(shù)，并基于靶向二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)，在匹配的 HCC 癌組織、癌旁組織、外周血細(xì)胞與血漿樣本中進(jìn)行了深覆蓋度的mtDNA測(cè)序并分析mtDNA突變的一致性與差異性，以進(jìn)一步闡明血漿中mtDNA的突變情況，以及可能在HCC早期診斷、預(yù)后評(píng)估中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2017年9月23日至2017年12月18日在空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診的HCC患者癌組織及癌旁組織（距癌組織≤3 cm）、外周血細(xì)胞及血漿樣本，其中癌組織及癌旁組織為多點(diǎn)取材。樣本篩選標(biāo)準(zhǔn)：癌組織中腫瘤細(xì)胞比例＞90%且沒有壞死，癌旁組織中腫瘤細(xì)胞比例＜5%；所有樣本提取的DNA均于-20℃下保存。本研究最終共納入5例HCC患者，所有病例術(shù)前未經(jīng)放療、化療。5例HCC患者的臨床特征見表1。

表1 5例肝細(xì)胞癌患者的臨床病理特征Tab.1 Clinicopathological characteristics of five HCC patients

1.2 主要試劑與儀器

E.N.Z.A組織DNA提取試劑盒和E.N.Z.A血液DNA 提取試劑盒購(gòu)自 Omega（New York，USA），QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit購(gòu)自 Qiagen（Dusseldorf，Germany），NEB Ultra v2 Kit購(gòu)自 New England Biolabs（Ipswich，US），Dynabeads 購(gòu) 自 Life（Massachusetts，USA）。Illumina HiSeq×Ten，Qubit 3.0 熒光定量?jī)x和Nonodrop分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific（Massachusetts，USA），Agilent 2100 bioanalyzer system購(gòu)自Agilent（California，USA）。

1.3 DNA的提取和定量

按照E.N.Z.A組織和血液DNA提取試劑盒說(shuō)明書分別提取HCC患者癌組織、癌旁組織和相應(yīng)外周血細(xì)胞中的DNA，并用Nonodrop分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量。采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取HCC患者血漿中的游離DNA（cell free，cfDNA），并用Qubit 3.0熒光定量?jī)x檢測(cè)cfDNA的濃度和質(zhì)量。

1.4 DNA測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

從HCC癌組織、癌旁組織及外周血細(xì)胞樣本中分別取5 μg DNA，按照超聲打斷、末端修復(fù)、加A尾、接頭連接、擴(kuò)增順序進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建；同時(shí)取1 μg血漿cfDNA，根據(jù)NEB Ultra v2 Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。將構(gòu)建的全基因組文庫(kù)置于Illumina HiSeq×Ten平臺(tái)進(jìn)行雙端150 bp測(cè)序。

1.5 靶向捕獲測(cè)序

將自制生物素標(biāo)記的mtDNA探針［11］與DNA文庫(kù)進(jìn)行雜交。根據(jù)鏈霉親和素磁珠與生物素特異性結(jié)合的原理，用mtDNA探針結(jié)合目標(biāo)片段，經(jīng)磁珠純化后獲得特異性產(chǎn)物。將捕獲的特異性產(chǎn)物置于Illumina HiSeq×Ten平臺(tái)進(jìn)行雙端150 bp測(cè)序。

1.6 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，條件包括：⑴去除接頭污染的Reads；⑵去除低質(zhì)量的Reads；⑶去除含N堿基比例＞5%的Reads。將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)通過(guò)BWA-mem軟件比對(duì)至人類參考基因組hg19，提取比對(duì)至線粒體參考基因組（the revised cambridge reference sequence，rCRS）的數(shù)據(jù)，計(jì)算mtDNA拷貝數(shù)和片段分布并進(jìn)行突變位點(diǎn)分析。mtDNA拷貝數(shù)=2×mtDNA depth/nuclear depth。mtDNA異質(zhì)性突變頻率＝含突變位點(diǎn)的Reads/總 Reads。異質(zhì)性突變分析的過(guò)濾條件包括：⑴兩條鏈上的次等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≥2%；⑵每條鏈上攜帶突變的Reads≥3；⑶總測(cè)序深度≥100×。將MAF≥98%的突變定義為同質(zhì)性突變。本研究將癌組織和癌旁組織的多點(diǎn)取材數(shù)據(jù)分別合并進(jìn)行突變分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Graphpad prism 5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用配對(duì)的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析癌組織和血漿樣本中拷貝數(shù)和突變頻率的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者癌組織與血漿樣本mtDNA拷貝數(shù)的比較

全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，血漿樣本中mtDNA拷貝數(shù)平均值為 4.30，中位值為 2.87（1.92～7.84）；癌組織中mtDNA拷貝數(shù)平均值為868.60，中位值為887.56（517.71～1 086.00）。HCC患者血漿中的mtDNA拷貝數(shù)較癌組織明顯降低（Z＝-2.023，P=0.008），見圖 1。

2.2 HCC患者癌組織、癌旁組織、外周血細(xì)胞與血漿樣本中的突變位點(diǎn)。

對(duì)5例HCC患者癌組織、癌旁組織、外周血細(xì)胞、血漿樣本進(jìn)行靶向捕獲測(cè)序，平均測(cè)序深度分別為 4 683×、5 447×、4 223×、3 335×，見表 2。靶向捕獲測(cè)序結(jié)果顯示，癌組織、癌旁組織、外周血細(xì)胞和血漿樣本可分別鑒定出181、180、181、179個(gè)同質(zhì)性突變和 33、42、3、78 個(gè)異質(zhì)性突變，見表 3。其中，4 種類型樣本可檢測(cè)到相同的同質(zhì)性突變位點(diǎn)；癌組織與血漿樣本中可檢測(cè)到相同的異質(zhì)性突變位點(diǎn)，平均突變個(gè)數(shù)為4.2；但癌旁組織與血漿樣本中檢測(cè)不到相同的異質(zhì)性突變位點(diǎn)，見圖2。癌組織、癌旁組織、血漿中可分別檢測(cè)到10、39、56個(gè)特異性突變位點(diǎn)。

2.3 HCC患者癌組織與血漿樣本中突變頻率的比較

根據(jù)上述5例HCC患者癌組織及血漿樣本的突變結(jié)果分析其異質(zhì)性突變頻率，結(jié)果顯示，癌組織平均異質(zhì)性突變頻率為0.0888，中位值為0.0837（0.0420～0.1563）；血漿樣本平均異質(zhì)性突變頻率為0.0679，中位值為 0.0596（0.0351～0.1055），兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝-1.367，P=0.219），見圖 3。

圖1 血漿及腫瘤組織中mtDNA拷貝數(shù)的比較Fig.1 Comparison of mtDNA copy numbers in plasma and tumor tissues

圖2 癌組織、癌旁組織、外周血細(xì)胞和血漿樣本中的突變位點(diǎn)數(shù)量Fig.2 The number of mutation sites in tumor tissues，adjacent tissues，peripheral blood cells and plasma

表2 mtDNA測(cè)序數(shù)據(jù)概況Tab.2 Summary of mtDNA sequencing data

表3 5例肝細(xì)胞癌患者的突變位點(diǎn)數(shù)量Tab.3 The number of variants for five HCC patients

圖3 癌組織與血漿樣本中的突變頻率Fig.3 The mutation frequency between tumor tissues and plasma

3 討論

mtDNA突變?cè)谀[瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用［12］。mtDNA是一段雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)。與核DNA相比，檢測(cè)mtDNA突變及拷貝數(shù)變異有以下獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［13-14］：⑴線粒體DNA全長(zhǎng)僅有16 569 bp，測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量小，檢測(cè)快速、成本低；⑵mtDNA拷貝數(shù)高，一個(gè)細(xì)胞中可含幾百至幾千個(gè)mtDNA的拷貝；⑶腫瘤細(xì)胞中mtDNA常存在于高水平活性氧環(huán)境下，且缺少組蛋白保護(hù)和有效的DNA修復(fù)系統(tǒng)，突變頻率較核基因組高10倍左右。目前傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)如Sanger測(cè)序已被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)癌癥的體細(xì)胞mtDNA突變［8-10］，但操作復(fù)雜，檢測(cè)靈敏度低，臨床應(yīng)用受限。NGS技術(shù)為系統(tǒng)檢測(cè)多種類型癌癥中的mtDNA異質(zhì)性突變提供了便利，已越來(lái)越多地應(yīng)用于mtDNA突變檢測(cè)中。由于線粒體基因組小，在測(cè)序之前，應(yīng)從包括基因組DNA和mtDNA在內(nèi)的總細(xì)胞DNA中分離mtDNA，以降低測(cè)序成本并簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)分析流程。富集mtDNA包括兩種主要策略：一種是首先通過(guò)密度梯度離心從細(xì)胞中分離線粒體，然后通過(guò)DNA提取試劑盒從分離的線粒體中提取DNA，但該方法不適用于血漿樣本；另一種是從細(xì)胞中提取總DNA，然后通過(guò)基于靶向擴(kuò)增或靶向捕獲的方法獲得mtDNA。本研究基于靶向NGS技術(shù)系統(tǒng)全面分析了HCC患者癌組織、癌旁組織、外周血細(xì)胞及血漿中的mtDNA突變。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法不僅實(shí)現(xiàn)了100%的覆蓋度，測(cè)序質(zhì)量Q30高于90%，且mtDNA的富集效率即mtDNA比對(duì)率＞50%，同時(shí)可以準(zhǔn)確地檢測(cè)突變頻率低至2%的mtDNA突變。此外，還通過(guò)4種配對(duì)樣本的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確識(shí)別了與HCC相關(guān)的mtDNA突變，說(shuō)明該方法有效、可行，且能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)血漿中的低頻突變。

目前大多研究集中于檢測(cè)HCC患者組織樣本或外周血細(xì)胞中的mtDNA突變［14］，鮮見檢測(cè)cf-mtDNA突變的研究。有研究使用單分子實(shí)時(shí)（single-molecule real-time，SMRT）測(cè)序技術(shù)對(duì)來(lái)自8例癌癥患者的19例組織樣本和9例血漿樣本的mtDNA進(jìn)行了突變分析，結(jié)果在血漿中幾乎檢測(cè)不到腫瘤特異性mtDNA突變［15］。本研究在血漿中檢測(cè)到了較癌組織中明顯增多的mtDNA突變，說(shuō)明血漿樣本能夠克服腫瘤組織異質(zhì)性。此外，在血漿中觀察到的mtDNA突變頻率與癌組織中的mtDNA突變頻率無(wú)明顯差異，提示血漿樣本很大程度上可反映腫瘤細(xì)胞中的mtDNA突變特征，可代替癌組織樣本進(jìn)行mtDNA突變分析。在HCC患者癌組織與血漿樣本中還觀察到mtDNA拷貝數(shù)存在顯著性差異，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析提供了重要的理論依據(jù)。值得注意的是，在實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，要根據(jù)不同的樣本類型設(shè)置不同參數(shù)，例如探針的使用量、探針的長(zhǎng)度、擴(kuò)增次數(shù)，數(shù)據(jù)質(zhì)控條件等。

綜上所述，本研究使用基于靶向NGS技術(shù)在HCC患者血漿中檢測(cè)到腫瘤來(lái)源的mtDNA突變，同時(shí)還準(zhǔn)確地檢測(cè)出血漿樣本中的低頻突變；血漿中的mtDNA有望成為HCC的潛在診斷或預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物，可作為組織活檢的有力補(bǔ)充。但本研究樣本量較小且未分析血漿中mtDNA突變與HCC生存的關(guān)系。因此，該法的臨床實(shí)用性有待在大型HCC患者隊(duì)列中進(jìn)一步評(píng)估。