孫艷平 王榮 楊寬 申旭霽 汪興軍

（西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安710021）

黃精（P sibiricum Red．）是臨床上重要的中藥材，全球約有50多種，主要分布在北溫帶、北亞熱帶，而我國(guó)具有31種，多分布在南方熱帶以外地區(qū)［1］?！吨袊?guó)藥典》2010版收載的黃精原植物有三種：黃精（P．sibiricum Red．）、多花黃精（P．cyrtonema Hua）、滇黃精（P．kingianum Coll．et Hemsl）。黃精的藥用部位是根莖，能補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎作用［2］。用于脾胃虛弱，體倦乏力，口干食少，肺虛燥咳等癥狀。黃精身份相對(duì)較多，包括：木質(zhì)素、多糖、氨基酸、皂苷類、微量元素等，且以多糖、皂苷類含量較高［3］?，F(xiàn)代藥理 結(jié) 果 表 明［4－5］：黃 精 具 有 抗 衰 老、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、改善記憶、抗腫瘤等作用。黃精顆粒屬于常用的中成藥，且與傳統(tǒng)藥物相比具有藥物使用方便、安全性高等特點(diǎn)，但是臨床上對(duì)于其藥物成分缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［6］。高效液相色譜法簡(jiǎn)稱HPLC，是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，以高壓輸送流動(dòng)相，采用高效固定相及高靈敏度檢測(cè)器，發(fā)展而成的現(xiàn)代液相色譜分析方法［7］。本研究以黃精顆粒和提取物為對(duì)象開展研究，探討HPLC 在黃精顆粒和提取物的含量測(cè)定效果。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 （1）儀器：托盤天平；分析天平；碾槽；量筒；燒杯；玻璃棒；紗布；蒸發(fā)皿；標(biāo)準(zhǔn)篩；砂鍋；Agilent Technologies 1220Infinity LC高效液相色譜儀，購(gòu)于美國(guó)安捷倫科技有限公司；Agilent HC－C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），KQ－250B 型超聲清洗器，購(gòu)于昆山市超聲儀器有限公司；容量瓶；移液管；注射器；0．45μm 微孔濾膜；進(jìn)樣針。（2）試劑為黃精粉末；黃精顆粒；色譜乙腈（美國(guó)制造）（批號(hào)：20130318）；薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）（批號(hào)：201403181）；純凈水。

1.2 黃精顆粒及提取物的制備 （1）黃精顆粒制備：取黃精藥材100g于碾槽中碾碎取出，放入砂鍋中加入800 mL 的自來水，浸泡20 分鐘，煎煮30min，過濾除雜，濾渣加入400 mL 自來水，煎煮30min，過濾除雜，合并濾液，濃縮至濃度為1.1左右（90～100mL），換到水浴鍋繼續(xù)濃縮至玻璃棒挑起成絲，稱量，記錄浸膏的量，趁熱加入蔗糖邊加邊攪至成團(tuán)，慢慢加入糊精邊加邊制成握之成團(tuán)，觸之即散狀態(tài)，過16目篩，過篩后的顆粒在60－80 ℃烘箱中干燥，整粒，備用［8］。（2）黃精顆粒提取物制備：分別精密稱取黃精顆粒7g（相當(dāng)于原藥材2g）和藥材粉末2g，置具塞錐形瓶中，按料液比為1∶20加入80%的乙醇，超聲提取2次，溫度60 ℃，時(shí)間50min，過濾，合并濾液，蒸干，加入20mL 蒸餾水溶解，加入20 mL 的正丁醇萃取二次，正丁醇層置于具塞錐形瓶中保存；向錐形瓶中加入少量甲醇溶解，分別置于10mL的容量瓶中，加入甲醇定容，置于2 ℃冰箱中保存，備用［9］。取樣品提取液1mL，加5%α－萘酚乙醇液3滴，搖勻后沿試管壁緩緩加入濃硫酸，觀察試管內(nèi)液體顏色變化并記錄。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 Agilent Technologies 1220Infinity LC 高效液相色譜儀，Agilent HC－C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），以乙腈（A）和水（B）為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，梯度程序?yàn)椋? min：5% A；10 min：10% A；30 min：35% A；40 min：40% A；60 min：5% A。流 速1 mL／min，柱 溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)200nm，進(jìn)樣量20μL［10］。

1.3.2 對(duì)照試驗(yàn)的配置 精確稱取薯蕷皂苷元適量，加甲醇溶解配置成濃度為0．102 0mg／mL 的對(duì)照品溶液，0．45μm 的微孔濾膜過濾，備用。

1.3.3 高效液相圖譜供試品溶液制備 分別將干燥至恒重的藥材粉末2g和黃精顆粒精密稱取7g（相當(dāng)于原藥材2g），置具塞錐形瓶中，按料液比為1：20加入80%的乙醇，超聲提取2次，溫度60℃，時(shí)間50min，過濾，合并濾液，蒸干，加入20mL 蒸餾水溶解，加入（20mL，20mL）的正丁醇萃取二次，取正丁醇層，旋干，加入少量甲醇溶解，分別置于10mL 的容量瓶中，加入甲醇定容，0．45μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品。

1.3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取黃精顆粒1號(hào)連續(xù)進(jìn)樣5次進(jìn)行測(cè)定，分別對(duì)共有峰保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算RSD 值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于3%，因此，結(jié)果表明該儀器具有良好的精密度，見表1。

表1 精密度考察結(jié)果

1.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將配好的薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品按照1.4.2含量測(cè)定的色譜條件分別上樣（8、10、12、14、16、18、20μL），以上樣量和峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2和圖1。 結(jié)果顯示：薯蕷皂苷元在0．816μg～2．04μg內(nèi)線性良好，回歸方程：Y＝20．662X＋19．211，R2＝0．999 4，R＝0．999 7。

表2 薯蕷皂苷元的線性考察結(jié)果

圖1 薯蕷皂苷元的線性關(guān)系

1.4.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取黃精顆粒3號(hào)供試品5份，按照1.3.2供試品溶液的制備方法和1.4.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定，統(tǒng)計(jì)各共有峰的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算RSD 值。結(jié)果如下圖表明它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均都小于3%，因此表明該儀器的重現(xiàn)性良好，見表3。

表3 重復(fù)性考察結(jié)果

1.4.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取黃精顆粒1 號(hào)供試品，在0、2、4、8、12小時(shí)依次進(jìn)樣測(cè)定，統(tǒng)計(jì)各共有峰的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算各共峰的RSD 值。結(jié)果表明它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于3%，因此說明該儀器在12小時(shí)內(nèi)的穩(wěn)定性良好，見表4。

表4 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2 結(jié) 果

經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比可以看書5號(hào)峰是薯蕷皂苷元。通過顆粒和原藥材色譜圖對(duì)比得知顆粒和原藥材中的化學(xué)成分沒變化，黃精顆粒中薯蕷皂苷元的含量比原藥材中的薯蕷皂苷元含量高，見表5—7和圖2—4。

表5 黃精顆粒各峰的峰面積和保留時(shí)間

表6 原藥材各峰的峰面積和保留時(shí)間

表7 含量測(cè)定結(jié)果

圖2 薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖3 黃精原藥材色譜圖

圖4 黃精顆粒的色譜圖

3 討 論

黃精顆粒是臨床上常用的中成藥物，具有滋補(bǔ)腎精、益氣補(bǔ)血功效，廣泛用于月經(jīng)量少、后錯(cuò)患者中［11－12］。但是，黃精顆粒臨床制備難度較大，本研究中黃精顆粒制備過程中多次均無法制備出顆粒，并且制備的顆粒均難以制成團(tuán)，難以完成藥物過濾、篩選，經(jīng)多次嘗試后發(fā)現(xiàn)，制備顆粒時(shí)需要在藥材浸潤(rùn)成膏時(shí)給予蔗糖作為敷料，邊加邊攪拌成稠狀，然后在慢慢加入糊精制握之成團(tuán)觸之即散的狀態(tài)［13］。同時(shí)，本研究中制劑、原料均給予超聲法提取，但是由于原材料中雜質(zhì)相對(duì)較多，抽濾時(shí)可給予提取液通過濾紙極慢。因此，本研究中給予棉花將原藥材提取物中的雜質(zhì)過濾一遍，然后再抽濾，這樣使得提取液更容易通過濾紙。此外，HPLC 制備時(shí)以甲醇、乙腈、水為流動(dòng)相選擇最適合的流動(dòng)相，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相以乙腈－水為佳。然后以乙腈－水為流動(dòng)相采用二元梯度洗脫。通過不斷的更換流動(dòng)相梯度，最后以1.4.1 高效液相圖譜的色譜條件中的梯度掃出的峰相對(duì)較多，峰型相對(duì)較好。因此選用1.4.1高效液相圖譜的色譜條件中的梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

查閱文獻(xiàn)資料［14］，選擇薯蕷皂苷元的檢測(cè)波長(zhǎng)（200nm、210nm、203nm）進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)在200nm 處出峰較號(hào)而且出峰較多。因此選用檢測(cè)波長(zhǎng)為200nm 進(jìn)行色譜研究。在方法學(xué)考察中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品線性進(jìn)行考察時(shí)，剛開始掃出峰時(shí)間長(zhǎng)而且雜峰多，還以為是標(biāo)準(zhǔn)品有問題，因此又換了不同廠家的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定結(jié)果樣品不僅不出峰而且高效液相儀的梯度泵壓幾乎不到1，經(jīng)過分析才發(fā)現(xiàn)可能是高效液相色譜儀器工作時(shí)間太長(zhǎng)了，因此關(guān)了儀器等了幾天后使用儀器才恢復(fù)正常，標(biāo)準(zhǔn)品出峰的時(shí)間也比原來的出峰時(shí)間縮短了，而且峰性較好，峰面積穩(wěn)定［15］。含量測(cè)定是制出的顆粒中薯蕷皂苷元的含量高于原藥材中薯蕷皂苷元的含量，可能是由于實(shí)驗(yàn)存在正負(fù)誤差或者是由于顆粒在提取的時(shí)候比原藥材多提取了一次，因此做出這樣的結(jié)果，結(jié)果表明：經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比可以看書5號(hào)峰是薯蕷皂苷元。通過顆粒和原藥材色譜圖對(duì)比得知顆粒和原藥材中的化學(xué)成分沒變化，黃精顆粒中薯蕷皂苷元的含量比原藥材中的薯蕷皂苷元含量高。

綜上所述，將HPLC法用于黃精顆粒和提取物含量測(cè)定中效果理想，具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)；黃精顆粒中的薯蕷皂苷元含量比原藥材中的薯蕷皂苷元含量高。