劉南南 袁鳳英 王桂清

摘要：為明確遼細辛精油對植物病害致病細菌的作用效果，以瓜類果斑病菌為靶標菌，以鏈霉素等化學農藥為陽性對照，采用渾濁度法和抑菌圈法研究遼細辛精油抑菌活性。結果表明，遼細辛精油對瓜類果斑病菌具有一定的抑菌效果，但效果不理想，僅當濃度≥2?000?mg/L時表現為抑制作用，否則表現出促進作用;遼細辛精油對瓜類果斑病菌的作用效果不及鏈霉素和氫氧化銅等化學農藥，但與葉枯唑等個別農藥的效果相當，且作用趨勢一致。

關鍵詞：遼細辛精油;瓜類果斑病;渾濁度法;紙片法;打孔法

中圖分類號：S792.26;?Q934.1????文獻標識碼：A????文章編號：1674-1161（2019）06-0010-04

瓜類果斑病又稱細菌性果腐病，是瓜類生產上的重大毀滅性病害之一，在國內局部地區(qū)發(fā)生，被列入官方控制之下，要求實施檢疫并加強防治。但目前，我國的細菌性病害的防治技術落后于真菌病害。植物精油來自于天然，環(huán)境兼容性好，且無論是以單種植物精油還是以多種植物精油混合物作為制劑，都具有良好的抑菌活性。遼細辛（Asarum?heterotropoides?Fr.Schmidt?var.mandshuricum（Maxim）Kitag）為馬兜鈴科細辛屬植物，是地道中草藥，其活性成分主要為精油，對植物病害致病真菌具有良好的抑菌效果。以瓜類果斑病菌為靶標菌，以鏈霉素等化學農藥和辛夷精油為陽性對照，采用渾濁度法和抑菌圈法研究遼細辛精油作用效果，旨在確定遼細辛精油對植物病害致病細菌的作用效果，為開發(fā)新型抑/殺細菌植物源農藥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌種及培養(yǎng)

瓜類果斑病菌（Acidovorax?avenae?subsp.citrulli）由聊城大學植物病理研究室提供，采用平板劃線分離培養(yǎng)法培養(yǎng)。培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（BPA），即牛肉浸膏3?g、蛋白胨10?g、氯化鈉5?g、瓊脂20?g、蒸餾水1?000?mL。

1.2 供試制劑及配制

遼細辛精油采用超臨界CO2法萃取，辛夷精油采用蒸餾法提取，均由聊城大學農學院植物病理研究室提供。兩者均用微量二甲基亞砜溶解后，用無菌水配制成4?000?mg/L的母液。

72%農用硫酸鏈霉素可溶性粉劑（成都普惠生物工程有限公司），用無菌水溶解后制成400?mg/L母液;77%氫氧化銅可濕性粉劑（浙江瑞利生物科技有限公司），用無菌水溶解后制成2?000?mg/L母液;20%葉枯唑可濕性粉劑（浙江瑞利生物科技有限公司），用無菌水溶解后制成4?000?mg/L母液。

供試制劑母液用無菌水按表1配制成所需濃度。

1.3 活性測定方法

1.3.1 渾濁度法 制備含藥BPA培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的瓜類果斑病菌用生理鹽水懸浮至0.5個麥氏比濁度，向各處理培養(yǎng)基中分別接種100?μL菌液，以只含溶劑的處理做空白對照，在37?℃和120?rpm條件下震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)前采用比色法，在600?nm波長下分別測定各處理的OD值，待對照處理達到對數生長期時，再測定各處理的OD值。OD值越小，抑菌效果越好。細菌生長抑制率計算方法為：

P=（A0-A1）/A0

式中：P為生長抑制率，%;A0為空白對照的OD值增加值;A1為藥劑處理的OD值增加值。

1.3.2 紙片抑菌圈法 選取吸水性強、質地均勻的定性濾紙，打直徑6?mm的圓型紙片，120?℃下干熱滅菌2?h，按每100片紙片加入藥液0.5?mL的比例浸透，干燥后分裝。

將于BPA培養(yǎng)基上在37±1?℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48?h的瓜類果斑病菌，用生理鹽水制備成細菌懸浮液。用無菌棉拭子蘸取菌液，涂布于培養(yǎng)基表面，確保涂布均勻。待培養(yǎng)基水分被瓊脂吸收后，放置含藥圓紙片，每皿5張，間距不少于24?mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15?mm。37±1?℃恒溫培養(yǎng)48?h后取出，測量抑菌圈直徑，根據表2判斷結果。

1.3.3 打孔抑菌圈法 無菌條件下制作BPA培養(yǎng)基平板，凝固后，用外徑6?mm的打孔器在中央打孔1個，四周等距離打孔5個;在每孔中滴加少量0.5%瓊脂封底后，四周孔中加入不同濃度的供試制劑0.05?mL，中間孔加入同體積無菌水作為對照。于37±1?℃恒溫培養(yǎng)48?h后，測量抑菌環(huán)直徑大小，判斷藥物的抑菌效果。

1.4 數據處理

試驗數據處理由Excel完成，毒力分析由DPSv13.0專業(yè)版完成。

2 結果與分析

2.1 濁度法對瓜類果斑病菌的抑菌效果

采用渾濁度法測定不同制劑對瓜類果斑病菌的抑菌效果，結果見圖1和表3。

由圖1可知：鏈霉素對瓜類果斑病菌的抑菌效果最好，抑菌率61.09%～99.18%，EC50和EC90分別為19.172?mg/L和118.62?mg/L;其次為氫氧化銅，在其用藥量為鏈霉素5倍的情況下，抑菌率也不及鏈霉素，EC50和EC90分別為994.04?mg/L和2849.9?mg/L，即其抑菌50%的效果為鏈霉素的51.85倍，抑菌90%的效果為鏈霉素的24.03倍。

由表3可知：遼細辛精油和葉枯唑的用藥量相同，兩者的活性趨勢一致，即高濃度下抑制，低濃度下促進;兩者的抑菌效果也一致，當濃度≥2?000?mg/L時，對瓜類果斑病菌表現出一定的抑制作用，抑制率為7.51%～22.7%，當濃度≤1?000?mg/L，表現為促進作用，促進率13.56%～56.88%，說明遼細辛精油和葉枯唑對瓜類果斑病菌的作用效果一致。

辛夷精油的供試濃度與遼細辛精油完全一致，其對瓜類果斑病菌表現為促進作用，促進率88.05%～288.02%，明顯高于遼細辛精油。

2.2 紙片法對瓜類果斑病菌的抑菌效果

紙片法的抑菌圈試驗結果見圖2—3和表4。

由試驗結果可知：鏈霉素對瓜類果斑病菌的抑菌效果最好，濃度為400?mg/L時抑菌圈直徑為23?mm，表現為極敏;氫氧化銅次之，濃度為2?000?mg/L時抑菌圈直徑為20.97?mm，表現為極敏，濃度為500～1000?mg/L時表現為高敏，濃度為125～250?mg/L時表現為低敏，但其用藥量為鏈霉素的5倍;遼細辛精油和葉枯唑在濃度為4?000?mg/L時均產生明顯的抑菌圈，直徑分別為2.2?mm和15.07?mm，遼細辛精油表現為低敏感性，葉枯唑表現為高敏感性，且兩者的抑菌趨勢相同，抑菌圈直徑均隨藥劑濃度降低而減小，敏感性降低;辛夷精油在供試濃度下沒有抑菌圈，即對瓜類果斑病菌無抑菌效果。

2.3 打孔法對瓜類果斑病菌的抑菌效果

打孔法的試驗結果見圖4—5和表5。

由圖4和圖5可以看出，采用打孔法測定的不同制劑對瓜類果斑病菌的抑菌效果與紙片法一致，且各制劑的抑菌活性趨勢也相同，不同制劑供試濃度下的抑菌圈直徑大小稍有變化，但變化不大。

比較渾濁度法和抑菌圈法，渾濁度法需要分光光度計測定OD值，操作復雜，效果也不及抑菌圈法直觀;比較紙片法和打孔法，紙片法操作簡單，抑菌圈明顯，更適合細菌的抑菌效果試驗。

3 結論與討論

遼細辛精油對植物病害致病細菌具有一定的抑菌效果，但效果不理想。當其濃度較高時，對瓜類果斑病菌表現為抑制作用，如濃度為4?000?mg/L時的抑菌率為16.21%，抑菌圈直徑為2.2?mm，濃度為2?000?mg/L時的抑菌率為9.44%，抑菌圈大小為1.03?mm;但當其濃度較低時，則無抑菌效果，甚至表現出促進作用，如濃度為250?mg/L時促進率為56.88%，無抑菌圈。

遼細辛精油對瓜類果斑病菌的作用效果與個別化學農藥的作用趨勢相同。研究中遼細辛精油的用藥量是鏈霉素的10倍，是氫氧化銅的2倍，但其抑菌效果不及后兩者，鏈霉素和氫氧化銅對瓜類果斑病菌表現出極高的抑制效果，EC50分別為19.172?mg/L和994.04?mg/L，而遼細辛精油在4?000?mg/L時的抑菌率僅為16.21%，說明其EC50將遠遠高于4?000?mg/L。遼細辛精油和葉枯唑的用藥量相同，兩者的活性趨勢一致，即高濃度下抑制，低濃度下促進;兩者的抑菌效果也很一致，當濃度≥2?000?mg/L時對瓜類果斑病菌表現出一定的抑制作用，但抑制率均低于22.7%，說明二者對瓜類果斑病菌的作用效果一致。

不同的植物精油對瓜類果斑病菌的作用效果不同，遼細辛精油在高濃度下具有一定的抑菌效果，而辛夷精油即使在高濃度下也無抑菌效果，反而表現為促生長作用。

當前，有關植物提取物對植物病原菌抗菌活性的研究較少，但植物是最好的化學合成殺菌劑替代品。許多植物精油具有多重生物活性，即具有殺蟲活性，也具有抑菌活性，具有較大市場潛力和良好的發(fā)展前景。

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Bacteriostatic?Effect?of?the?Asarum?Essential?Oil?on?Acidovorax?Citrulli

LIU?Nannan，?YUAN?Fengying，?WANG?Guiqing*

（College?of?Agronomy，?Liaocheng?University，?Liaocheng?Shandong?252059，?China）

Abstract：?In?order?to?clarify?the?effect?of?asarum?essential?oil?on?bacteria?causing?plant?diseases，?the?bacteriostatic?activity?of?asarum?oil?was?studied?by?turbidity?method?and?bacteriostatic?zone?method，?with?Acidovorax?citrulli?as?the?target?bacteria?and?chemical?pesticides?such?as?streptomycin?as?the?positive?control.The?results?showed?that：?The?Asarum?essential?oil?has?certain?bacteriostatic?effect?on?Acidovorax，?however?the?effect?is?not?ideal.?It?only?shows?inhibitory?effect?when?the?concentration?is?greater?than?or?equal?to?2?000?mg/L，?otherwise?it?showed?promoting?effect;?The?effect?of?the?Asarum?essential?oil?on?the?Acidovorax?was?less?than?that?of?chemical?pesticides?such?as?streptomycin?and?cupric?hydroxide，?whereas?the?effect?was?similar?to?that?of?individual?pesticides?such?as?bacuzole，?and?the?action?trend?was?consistent.

Key?words：?Asarum?essential?oil;?Acidovorax?citrulli;?turbidity?method;?paper?method;?punch?method