杜科業(yè)，楊東亮，劉 嘉

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球最常見的傳染病之一，是嚴(yán)重影響人類健康的公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)，全球約有2.57億慢性HBV感染者。慢性乙型肝炎病情反復(fù)遷延，可致肝纖維化，并逐步進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[1]。對(duì)于慢性HBV感染，抗病毒治療可以有效控制病毒復(fù)制，改善絕大多數(shù)患者的臨床狀況，并降低死亡率和發(fā)病率。但現(xiàn)在的抗病毒藥物存在停藥后反彈等問題，大多數(shù)慢性乙型肝炎患者需要接受終生治療，較難實(shí)現(xiàn)慢性HBV感染的功能性治愈。特異性T細(xì)胞活化和應(yīng)答在清除HBV肝內(nèi)感染方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。急性自限性HBV感染患者體內(nèi)通?？蓹z出針對(duì)多個(gè)HBV表位的特異性CD8+T細(xì)胞，去除HBV急性感染黑猩猩體內(nèi)CD8+T，則HBV難以被清除而導(dǎo)致感染持續(xù)；在慢性HBV感染患者體內(nèi)，CD8+T細(xì)胞應(yīng)答缺失或減弱，處于功能性耗竭狀態(tài)[3]。調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是 CD4+T細(xì)胞中的一種特殊亞群，可以抑制或者下調(diào)效應(yīng)性T細(xì)胞的功能和增殖，從而維持免疫耐受狀態(tài)或抑制自發(fā)性免疫的產(chǎn)生[4]。Treg細(xì)胞在效應(yīng)性T細(xì)胞功能損傷及建立慢性HBV感染中發(fā)揮著重要作用。本文就Treg細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)、分類及其在HBV感染過程中發(fā)揮的作用加以介紹。

1 Treg細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

Gershon及其同事在上世紀(jì)70年代就提出了“T細(xì)胞介導(dǎo)免疫抑制”的概念[5]，但直到80年代，才在小鼠和大鼠的自身免疫性疾病模型中發(fā)現(xiàn)了一群特殊的T細(xì)胞亞群，這群細(xì)胞在阻止自身免疫發(fā)生中發(fā)揮著重要作用[6]。然而，由于缺乏特異性的細(xì)胞標(biāo)志物，關(guān)于這群特殊的T細(xì)胞亞群的研究推進(jìn)受到了影響。90年代，Sakaguchi et al在將敲除了CD4+CD25+的T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)輸?shù)铰闶篌w內(nèi)后誘發(fā)了自身免疫性疾病的發(fā)生[7]。相反地，重新補(bǔ)充CD4+CD25+T細(xì)胞可以有效抑制自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。最終，這群結(jié)構(gòu)性表達(dá)白細(xì)胞介素 2（interleukin-2，IL-2）受體 CD25分子的 T細(xì)胞亞群被命名為“Treg”。不久后，相似的結(jié)果在人體實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)[8]。

但值得注意的是，Treg很難十分有效地與效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，這是由于效應(yīng)T細(xì)胞同樣可以表達(dá)CD4和CD25，甚至在CD25高表達(dá)的T細(xì)胞群中依然包含有50%剛活化的T細(xì)胞。因此，CD4和CD25兩種標(biāo)志物并不足以將Treg從常規(guī)T細(xì)胞中區(qū)分出來，特別是與效應(yīng)T細(xì)胞相區(qū)分。隨著對(duì)Treg研究的深入，F(xiàn)oxP3被進(jìn)一步證實(shí)為決定CD4+CD25+Treg細(xì)胞表型及功能的主要調(diào)節(jié)分子[9]，研究表明當(dāng)FoxP3的表達(dá)受損或者下調(diào)時(shí)，Treg抑制性功能也會(huì)受到影響，逆轉(zhuǎn)FoxP3的表達(dá)后這群細(xì)胞會(huì)重新獲得調(diào)節(jié)性功能。目前，Treg被認(rèn)為主要從初始 CD4+T細(xì)胞分化而來，CD4、CD25和FoxP3是其最主要的標(biāo)志物[10]。

2 Treg細(xì)胞亞群

根據(jù)發(fā)育機(jī)制的不同，目前Treg主要分為兩個(gè)亞群：即自然調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（natural Treg，nTreg）和誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（inducible Treg，iTreg）。nTreg來源于胸腺細(xì)胞，在胸腺內(nèi)分化、發(fā)育、成熟，而iTreg可由外周初始T細(xì)胞分化而來，或在持續(xù)小劑量的抗原刺激下由已分化的T細(xì)胞發(fā)展而來[11]。

2.1 nTreg nTreg作為CD4+T細(xì)胞的一個(gè)重要亞群，在胸腺中發(fā)育，并可以從胸腺釋放至外周血中發(fā)揮作用，遷移出胸腺的nTreg約占正常人或小鼠外周CD4+T細(xì)胞的5%～10%[12]。 但nTreg發(fā)育并獲取抑制能力所需的信號(hào)依然還不清楚，在TCR轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中，人們發(fā)現(xiàn)，胸腺中的Treg發(fā)育需要高親和力TCR刺激并依賴于B7分子的共刺激信號(hào)[13]。nTreg構(gòu)成獨(dú)特的胸腺來源的T細(xì)胞譜系，其具有抑制抗原呈遞細(xì)胞（APC）活化和功能的能力，如樹突細(xì)胞（DC）、單核細(xì)胞和B細(xì)胞以及效應(yīng)T細(xì)胞[14]。在外周循環(huán)中nTreg主要表達(dá)CD25、Foxp3、CCR4、PD-1 和低水平的 CD127，并且它們通過分泌IL-10、IL-35、TGF-β發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。其中Foxp3被認(rèn)為是小鼠和人類中Treg的最特異性標(biāo)記物[15]。

2.2 iTreg iTreg細(xì)胞在生理應(yīng)激或疾病狀況下可在胸腺外發(fā)育，并在胸腺外通過炎癥和疾病過程的誘導(dǎo)獲得CD25的表達(dá)，如自身免疫性疾病或癌癥。 iTreg細(xì)胞頻率和功能特性很重要，因?yàn)閕Treg數(shù)量的增加可能有利于慢性感染的建立[16]。iTreg和nTreg具有相似的功能，nTreg細(xì)胞與iTreg細(xì)胞在維持耐受性方面的貢獻(xiàn)尚不清楚，但兩者都很重要。在nTreg和iTreg細(xì)胞之間觀察到表觀遺傳差異，前者具有更穩(wěn)定的Foxp3表達(dá)和更廣泛的去甲基化。有研究顯示，CD39+iTreg細(xì)胞與CD39-iTreg細(xì)胞相比顯示出增強(qiáng)的增殖和抑制能力以及更低的炎性細(xì)胞因子表達(dá)[17]。Notch和TGF-β信號(hào)通路在iTreg分化中發(fā)揮著重要作用。已經(jīng)觀察到，在HBV相關(guān)的肝損傷的不同階段，Notch信號(hào)傳導(dǎo)參與調(diào)節(jié)外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和肝臟中 FoxP3+Treg。阻斷肝臟浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中的Notch信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)顯著降低FoxP3的表達(dá)，強(qiáng)烈表明Notch信號(hào)影響FoxP3表達(dá)[18]。

在急性HBV感染時(shí)，Notch信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞增殖活化產(chǎn)生IFN-γ。然而，在慢性HBV感染時(shí)，Notch信號(hào)分子的表達(dá)降低，但隨著乙型肝炎肝硬化和HCC的發(fā)展，Notch表達(dá)再次增加。在HBV感染的肝硬化患者Notch可誘導(dǎo)肝內(nèi)淋巴細(xì)胞表達(dá)FoxP318。除Notch外，TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)也有助于區(qū)分肝硬化和HCC患者iTregs與普通T細(xì)胞。同時(shí)，Notch信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)TGF-β功能[19]。

3 Treg免疫抑制機(jī)制

Treg發(fā)揮免疫抑制的機(jī)制目前依然不是很清楚，但有越來越多的證據(jù)表明Treg可通過多種機(jī)制發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，如分泌抑炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β[20]。此外，Treg表達(dá)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白 4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4）等免疫共抑制分子，并可通過細(xì)胞接觸來發(fā)揮其抑制作用[21]。除上述機(jī)制外，IL-2受體CD25在Treg上的高表達(dá)導(dǎo)致Treg與效應(yīng)T細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-2，從而使效應(yīng)T細(xì)胞處于“饑餓”狀態(tài)，抑制其增殖并最終導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞凋亡。給予外源IL-2則可以消除Treg介導(dǎo)的增殖抑制作用[22]。然而，有研究表明，Treg抑制T細(xì)胞功能，IL-2的消耗并不是抑制增殖的原因，因?yàn)橥ㄟ^阻斷CD25并未在Treg的最佳刺激條件下消除抑制。值得注意的是，在次優(yōu)刺激條件下，人類Treg需要CD25信號(hào)才能獲得抑制能力，Treg的IL-2消耗和對(duì)靶細(xì)胞的抑制可能僅在某些情況下起作用[23]。

IL-35是新近發(fā)現(xiàn)與Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制作用有關(guān)的細(xì)胞因子，可以直接抑制T細(xì)胞增殖[24]。IL-35表達(dá)缺陷的Treg在體外和體內(nèi)的抑制能力均明顯降低。與小鼠Treg相反，人類Treg并不表達(dá)IL-35。盡管如此，IL-35依然可能在人體免疫抑制中發(fā)揮重要作用，因?yàn)橛肐L-35處理人或小鼠初始T細(xì)胞均誘導(dǎo)產(chǎn)生了所謂的iTR35調(diào)節(jié)群，該群體通過IL-35的介導(dǎo)發(fā)揮抑制作用，并且不需要IL-10或TGF-β的參與[25]。雖然人類幼稚Treg沒有大量表達(dá)IL-35，但長(zhǎng)期刺激Treg可以導(dǎo)致IL-35表達(dá)上調(diào)。這些活化的Treg以IL-35依賴性方式發(fā)揮與非接觸依賴性的體外抑制作用，并且還誘導(dǎo)iTR35細(xì)胞的產(chǎn)生[26]。

4 Treg與HBV

HBV感染可以誘導(dǎo)Treg數(shù)量及在肝內(nèi)浸潤(rùn)增加。來自HBV感染小鼠模型的研究工作顯示，急性HBV感染過程中肝內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量顯著增多，但其增殖水平并未增加，提示Treg為趨化募集進(jìn)入肝臟。進(jìn)一步的表型分析顯示在此過程中Treg的表型并未出現(xiàn)明顯改變，但其仍然保留了抑制HBV特異性效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答的能力[27，28]。敲除Treg可以導(dǎo)致肝內(nèi)HBV特異性T細(xì)胞增強(qiáng)且病毒清除加速，但同時(shí)也會(huì)加重肝臟損傷，提示Treg在急性HBV感染過程中發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)度和避免免疫損傷的生物學(xué)效應(yīng)。在慢性HBV感染過程中，Treg的數(shù)量亦顯著增多。相比于健康人和自限性恢復(fù)的個(gè)體，在慢性乙型肝炎患者外周血單核細(xì)胞和肝內(nèi)中有著更高頻率的CD4+CD25+Treg細(xì)胞，并與血清病毒載量呈正相關(guān)[29]。將Treg去除后，患者外周血單個(gè)核細(xì)胞針對(duì)HBsAg刺激產(chǎn)生IFN-γ的水平顯著增加。

慢性乙型肝炎患者體內(nèi)Treg的數(shù)量也與是否接受抗病毒治療有關(guān)。有研究表明，核苷類似物治療可以顯著降低外周循環(huán)中Treg的比例，且這種降低伴隨著HBV特異性T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng)，同時(shí)HBV DNA下降[30，31]。除核苷類似物外，聚乙二醇干擾素（peg-IFNα）治療同樣可以顯著減少慢性乙型肝炎患者外周循環(huán)中Treg細(xì)胞的數(shù)量。另外，Treg和Th17應(yīng)答平衡是機(jī)體免疫功能變化的重要指標(biāo)。研究顯示，與健康對(duì)照組相比，慢性乙型肝炎患者體內(nèi)Th17細(xì)胞數(shù)量亦顯著增加，且IL-17水平也明顯增高，這部分CHB患者在經(jīng)過Peg-IFNα治療后，Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞以及IL-17水平均明顯下降[32]。Treg/Th17比值還可用于預(yù)測(cè)核苷酸類似物治療CHB患者的應(yīng)答狀況。研究顯示在替比夫定的治療過程中，Treg/Th17比值基線值越低，經(jīng)治療后獲得HBeAg轉(zhuǎn)陰的幾率越大[33]。

Treg通過分泌IL-10和IL-35等抑炎細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。在乙型肝炎感染過程中可見IL-10表達(dá)水平升高，且IL-10水平與血清病毒滴度及肝臟炎癥程度密切相關(guān)[34]。在慢性HBV感染患者外周CD4+T細(xì)胞中可檢測(cè)到IL-35，而在健康個(gè)體中卻無法檢測(cè)到[35]。這些細(xì)胞因子可能通過抑制T細(xì)胞的增殖和效應(yīng)功能，從而參與乙型肝炎免疫耐受的維持。新近研究還顯示，Treg可通過其表達(dá)的CTLA-4抑制濾泡輔助性T細(xì)胞（Tfh）的功能，從而導(dǎo)致其無法輔助B細(xì)胞功能成熟產(chǎn)生中和性抗體，導(dǎo)致HBV感染持續(xù)。若通過抗體阻斷CTLA-4的功能，則可恢復(fù)Tfh和B細(xì)胞的活化，介導(dǎo)病毒的清除[36]。

5 總結(jié)

抗病毒免疫應(yīng)答的發(fā)生和強(qiáng)度受到免疫系統(tǒng)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)密調(diào)控。在慢性HBV感染過程中，病毒利用機(jī)體的免疫負(fù)調(diào)機(jī)制如免疫檢查點(diǎn)分子和Treg等來抑制抗病毒特異性免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)針對(duì)病毒的免疫耐受。設(shè)計(jì)針對(duì)這些免疫負(fù)向調(diào)控因子的靶向治療手段，有望重建CHB患者體內(nèi)的HBV特異性抗病毒免疫應(yīng)答，從而使患者能夠依靠自身免疫系統(tǒng)而非核苷類似物等抗病毒藥物實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV感染的持續(xù)性免疫控制，達(dá)到功能性甚至是徹底治愈的狀態(tài)。同時(shí)，我們必須看到Treg等免疫負(fù)調(diào)因素在維持機(jī)體免疫自穩(wěn)狀態(tài)中的重要作用，設(shè)計(jì)相應(yīng)免疫治療策略時(shí)需慎重和權(quán)衡利弊。因此，仍需進(jìn)一步深入闡明HBV感染過程中Treg發(fā)揮的生物學(xué)作用及其相關(guān)的細(xì)胞和分子機(jī)制。