盧敏，熊山，牟艷玲*

1.濟(jì)南大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200； 2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所/山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東 濟(jì)南 250062；3.國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250062；4.山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250062

香連丸是治下痢的古代名方，臨床上現(xiàn)多應(yīng)用于消化系統(tǒng)疾病的治療。通過文獻(xiàn)的初步考證，香連丸始于唐代李絳《兵部手集方》，至宋代《太平惠民和劑局方》名為“大香連丸”。據(jù)現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》及部頒藥品《標(biāo)準(zhǔn)》所載的中成藥香連丸為黃連和木香以相使配伍的關(guān)系組成，處方均為黃連(吳茱萸制)與木香4∶1，醋糊為丸[1-2]。方中黃連清熱燥濕、瀉火解毒、疏肝和胃止嘔，木香主治行氣止痛、健脾消食，二者組成香連丸，具有清熱化濕、行氣止痛之功效，主要用于痢疾、泄瀉、腸炎與胃炎等疾病[3]。

香連丸的主要成分為萸黃連、木香。黃連中有黃連堿、巴馬汀、藥根堿、鹽酸小檗堿等有效成分[4]，木香中有木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯等有效成分[5]?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版有對于香連丸中鹽酸小檗堿的高效液相色譜(HPLC)法定量測定方法，僅以鹽酸小檗堿作為質(zhì)量控制指標(biāo)，難以全面控制其質(zhì)量，有必要制定較為全面的香連丸多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。為了保證香連丸的用藥質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對香連丸中小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的含量同時(shí)進(jìn)行HPLC-MS/MS測定研究，為該復(fù)方香連丸多成分的質(zhì)量控制提供了一種簡單可行的定量方法，為提高檢測速度及更好地控制生產(chǎn)過程質(zhì)量提供了參考。

1 材料

1.1 儀器

ULTIMATE3000液相色譜-TSQ QUANTUM ULTRA質(zhì)譜聯(lián)用儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；SQP電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；D3024R臺式高速(冷凍型)微量離心機(jī)(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；IKA?Vortex天才3旋渦混勻器(廣州艾卡儀器設(shè)備有限公司)；KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

藥根堿對照品(批號：S0913AS)、小檗堿對照品(批號：F0126AS)、巴馬汀對照品(批號：B0613AS)、黃連堿對照品(批號：B0617AS)、木香烴內(nèi)酯對照品(批號：N1106AS)、去氫木香內(nèi)酯對照品(批號：A0708AS)均購自大連美侖生物有限公司，純度均大于98.0%；奧美拉唑?qū)φ掌?中國食品藥品檢定研究院，批號：100367-201305)；香連丸(蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號：16C2)；乙腈、甲醇(色譜純，美國賽默飛世爾公司)；甲酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 液相色譜條件 色譜柱采用Hypersil GOLD C18(50 mm × 2.1 mm，3 μm，Thermo)；流動相：A為0.1%的甲酸水，B為乙腈；梯度洗脫：0～0.2 min，A∶B(75∶25)；0.2～1.0 min，A∶B(75∶25～70∶30)；1.0～3.9 min，A∶B(70∶30～10∶90)；3.9～5.0 min，A∶B(10∶90)；5.0～6.0 min，A∶B(10∶90～75∶25)；流速0.5 mL min-1；進(jìn)樣量 2 μL；柱溫：25 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)；霧化溫度：250 ℃；噴霧電壓：3500 V；鞘氣壓力：35 Arb；輔助氣壓力：10 Arb；毛細(xì)管溫度：350 ℃；選擇離子采集模式，各被測物的部分質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 對照品的SRM條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取奧美拉唑?qū)φ掌愤m量，加甲醇溶液制成質(zhì)量濃度為2 mg mL-1的溶液，精密吸取該溶液適量，加甲醇稀釋至500 ng mL-1，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制 取本品適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上述上清液適量，用甲醇稀釋160倍，14 000 r min-1離心10 min，取上清液，即得。進(jìn)樣前，精密吸取各供試品溶液300 μL，內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，混勻，進(jìn)樣分析。

2.2.3 混合對照品溶液的配制 精密稱取小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯對照品適量，加甲醇溶液制成小檗堿1 μg mL-1，藥根堿、黃連堿、巴馬汀、木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯為0.5 μg mL-1的混合對照品溶液，即得。進(jìn)樣前，精密吸取混合對照品溶液300 μL，內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，混勻，進(jìn)樣分析。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取混合對照品溶液和供試品溶液按2.1.1和2.1.2項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件，進(jìn)樣2 μL，另取不含藥材的輔料作為空白溶液，同法進(jìn)樣。特征圖譜見圖1，小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的測定不受雜質(zhì)干擾，峰形良好，結(jié)果表明，在擬定的色譜和質(zhì)譜條件下，處方中的其他成分對測定結(jié)果無影響。

2.4 線性關(guān)系

分別吸取混合對照品溶液80、100、250、500、800、1000 μL，加甲醇定容至1.0 mL，分別吸取以上各混合對照品溶液300 μL，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，按2.1.1和2.1.2項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣2 μL測定，以被測組分與內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，測定進(jìn)樣質(zhì)量濃度與相應(yīng)質(zhì)譜峰面積的關(guān)系，求得它們的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表2。結(jié)果表明這6種化學(xué)成分在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，儀器靈敏度較高。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一混合對照品溶液2 μL按2.1.1和2.1.2項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件重復(fù)測定6次，計(jì)算小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的峰面積RSD分別為1.47%、1.49%、1.62%、1.82%、1.67%、1.30%，n=6，說明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品(批號：16C2)6份，每份約0.1 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的配制方法處理，按2.1.1和2.1.2項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，測得香連丸中小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為79.54、16.51、14.93、20.25、5.63、5.60 mg g-1，RSD分別為 0.45%、1.51%、1.02%、0.78%、0.88%、1.53%，n=6，表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液(批號：16C2)6份，分別于0、24 h按2.1.1和2.1.2項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定。采用T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，測得小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的含量在0、24 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(批號：16C2)9份，每份約0.05 g，精密稱定，按樣品含有量的80%、100%、120%添加對照品溶液后按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每種比例各配制3份，離心后分別按2.1.1和2.1.2項(xiàng)下色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，回收率結(jié)果見表3，結(jié)果表明該方法回收率良好。

注：A.空白溶液；B.對照品溶液；C.實(shí)際樣品；Ⅰ.去氫木香內(nèi)酯；Ⅱ.木香烴內(nèi)酯；Ⅲ.黃連堿；Ⅳ.小檗堿；Ⅴ.藥根堿；Ⅵ.巴馬汀。圖1 6種主要化學(xué)成分的SRM圖

表2 6種主要化學(xué)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

表3 加樣回收率檢測結(jié)果(n=9)

2.9 樣品含量測定

取本品適量，約0.1 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的配制方法處理，按2.1.1和2.1.2項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，測得香連丸中小檗堿、藥根堿、黃連堿、巴馬汀、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為80.99、18.21、16.98、22.79、4.47、5.12 mg g-1。

3 結(jié)論

近年來，隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)成為天然藥物復(fù)雜體系中活性成分快速分離和鑒定的有力手段。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[8-11]發(fā)現(xiàn)，目前香連丸中主要成分的含量測定使用的是HPLC，但存在分析方法時(shí)間較長、靈敏度較低等問題，HPLC-MS/MS與傳統(tǒng)的HPLC相比分析速度更快，分離度更好，靈敏度更高，縮短了分析時(shí)間，同時(shí)減少了溶劑用量、降低了分析成本[12]，通過方法學(xué)驗(yàn)證，該方法操作簡便、準(zhǔn)確、快捷，選擇性好，結(jié)果準(zhǔn)確，為有效控制香連丸質(zhì)量提供了方法，為多成分全面評價(jià)香連丸質(zhì)量提供一種思路。

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測定香連丸中主要成分的含量測定方法，通過對色譜條件進(jìn)行考察，包括乙腈和甲酸水的不同配比和梯度洗脫，柱溫和進(jìn)樣量的選擇，最終確定本實(shí)驗(yàn)色譜條件，能夠有效地將6種化學(xué)成分分離，質(zhì)譜信號用來定性和定量，質(zhì)譜SRM技術(shù)通過兩級離子選擇，排除大量干擾離子，目標(biāo)檢測物的信噪比顯著提高，從而實(shí)現(xiàn)了高靈敏度的檢測。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的方法簡便、精密度好、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，能夠有效測定香連丸中主要化學(xué)成分的含量。