宋海燕，李麗莉，李超，秦華偉，宋瑩瑩，盧增斌，于毅，門興元*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，濟(jì)南250100；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京210000）

植物內(nèi)生真菌一般是指全部或部分生活周期內(nèi)生活在植物體內(nèi)，但對宿主植物組織不引起明顯病害癥狀的1類真菌[1-2]。內(nèi)生真菌是巨大的資源寶庫，其次生代謝產(chǎn)物十分豐富，甚至可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的代謝產(chǎn)物，是天然產(chǎn)物的重要來源[3-5]。宿主植物與內(nèi)生真菌是互利互惠的共生關(guān)系，在長期進(jìn)化過程中形成了協(xié)同進(jìn)化機(jī)制，真菌的特定代謝產(chǎn)物能刺激宿主生長發(fā)育，提高其對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力[6-7]。例如，內(nèi)生真菌Cladorrhinum foecundissimumS8的接種可使棉花根腐病的發(fā)病率降低45.5%～70.0%[8]；多黏芽胞桿菌Paenibacillus poly-myxa、解木聚糖類芽孢桿菌Paenibacillus xylanilyticus和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis聯(lián)合處理的棉株，在開花期未發(fā)生黃萎病，并且3種菌聯(lián)合灌根處理效果優(yōu)于單菌株施用效果[9]。因此，植物內(nèi)生真菌已成為篩選新化合物和新藥的重要資源庫[10-12]。

棉花，錦葵科（Malvaceae）棉屬（Gossypium）植物，是世界上最主要的農(nóng)作物之一，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物和紡織原料來源[13]。大量的研究表明，棉花終生帶有內(nèi)生菌群[14-16]。目前對棉花內(nèi)生真菌的研究涉及內(nèi)生真菌分離、種屬鑒定、多樣性分析等方面，但缺乏系統(tǒng)性的研究。本文對內(nèi)生真菌在棉花葉、莖、鈴的群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析，明確不同部位內(nèi)生真菌的分布，旨在為棉花內(nèi)生菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017年在棉花花鈴期（7月13―22日），每個(gè)采樣地（表1）設(shè)置1個(gè)采樣點(diǎn)，采集新鮮健康的10株棉花樣本，將其立即放入密封袋中，貼上標(biāo)簽，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，在4℃下保存。

表1 采樣地情況簡介

采用馬鈴薯葡萄糖（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基分離內(nèi)生真菌。其中，新鮮馬鈴薯200 g，洗凈去皮后切成小塊，沸水煮30 min，用紗布過濾取濾液，加入瓊脂3.5 g，葡萄糖200 g，定容2 000 mL。121℃滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻至45℃時(shí)，加入質(zhì)量濃度為100 mg·L－1的硫酸鏈霉素1 mL防止細(xì)菌污染。

1.2 主要試劑和儀器

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；RXZ型智能人工氣候培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠生產(chǎn)；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；DYY-6D型電泳儀，北京六一儀器廠生產(chǎn)；5424小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司生產(chǎn)；SW-TFG-15型通風(fēng)柜，杭州得聚儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；HHC型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；749540-0000型微量電動(dòng)組織勻漿器，美國KIMBLE CHASE公司生產(chǎn)；2720熱循環(huán)儀，美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)；Gel-Doc-itTS3凝膠成像分析系統(tǒng)，美國UVP公司生產(chǎn)；引物ITS1、ITS4、真菌DNA提取試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣本表面消毒。選取無病害癥狀、新鮮健康的棉葉、棉莖、棉鈴用無菌水沖洗，去除表面的泥土和灰塵，用滅過菌的濾紙吸干表面的水分，室溫晾干。將棉葉剪成邊長2 cm的正方形葉片，棉莖剪成長約2 cm的小段，棉鈴切成1/2，均用75%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇浸泡30 s，然后用2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）次氯酸鈉浸泡3 min，用無菌水漂洗5次。最后，用滅菌的鑷子將棉葉、棉莖、棉鈴放置于滅菌濾紙上。

1.3.2內(nèi)生菌的分離、保存。將刀片在酒精燈火焰上灼燒滅菌，待冷卻后，將棉葉、棉莖邊緣去除，葉片剩余部分切成2個(gè)邊長約0.5 cm的正方形小塊，莖切成2個(gè)長約0.5 cm的小段。將各樣本放入裝好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并做好標(biāo)記，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。記錄被內(nèi)生真菌侵染的樣本數(shù)。

待平板上菌落長出，根據(jù)其形態(tài)特征判斷分離菌落種類，用取尖端菌絲或者平板劃線等方法分離純化，經(jīng)反復(fù)分離、純化，直至得到純化的菌落。將純化的菌株分別轉(zhuǎn)移至斜面培養(yǎng)基上，菌株生長旺盛時(shí)，取出至4℃下保存。

1.3.3內(nèi)生真菌的ITS鑒定。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）鑒定是指對序列進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物測序，通過將測序得到的序列與已知真菌序列比較，從而獲得未知真菌種屬信息的一種方法。本研究采用Ezup柱式真菌DNA提取試劑盒提取內(nèi)生真菌總DNA，使用真菌rDNA擴(kuò)增的通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴(kuò)增內(nèi)生真菌rDNA-ITS序列[12]。ITS擴(kuò)增的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系（25μL）：ddH2O 17.25μL，Buffer l 2.5μL，dNTPs 2μL，F(xiàn)引物 （ITS1）1μL，R引物（ITS4）1μL，HiFi酶0.25μL，模板DNA 1μL。PCR反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性3 min，93℃變性45 s，57℃復(fù)性45 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將ITS序列的測序結(jié)果用美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對，獲得分子鑒定結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用定植率（Colonization rate，CR）評估棉莖、棉鈴被內(nèi)生真菌侵染的程度；采用相對分離率（Relative frequency，RF）比較判斷優(yōu)勢菌屬；采用Shannon-Weaver指數(shù)（H）分析內(nèi)生真菌的群落生物多樣性；用Evenness（E）均勻度指數(shù)分析群落物種分布的均勻度；用Margalet豐富度指數(shù)（R）分析群落物種的豐富程度；用Jaccard相似性系數(shù)（Jaccard’s similarity coefficient，SJ）分析2個(gè)地區(qū)內(nèi)生真菌種類組成的相似程度。計(jì)算公式：CR＝（S/N）×100%，其中S指受內(nèi)生真菌侵染的樣本數(shù)，N指總樣本數(shù)；RF＝（Ni/N）×100%，其中Ni為某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)，N指總菌株數(shù)其中k指某宿主中內(nèi)生真菌的種類，Pi指某種內(nèi)生真菌的相對分離率；E＝H/lnS，其 中H為Shannon-Weaver指數(shù)，S為物種總數(shù)；R＝（S－1）/lnN，其中S為樣方內(nèi)物種數(shù)，N為樣方內(nèi)所有物種的個(gè)體總數(shù)；SJ＝j(luò)/（a＋b－j)，其中j指2個(gè)地區(qū)共有的內(nèi)生真菌菌屬數(shù)，a、b指2個(gè)地區(qū)各自分離到的內(nèi)生真菌的菌屬數(shù)。當(dāng)SJ為[0.00，0.25)時(shí)，為極不相似；SJ為[0.25，0.50)時(shí)，為中等不相似；SJ為[0.50，0.75)時(shí)，為中等程度相似；SJ為[0.75，1.00]時(shí)，為極為相似。

采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和曲線繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花不同部位內(nèi)生真菌定植率

圖1 棉花不同部位內(nèi)生真菌的定植率

由圖1可知，4個(gè)地區(qū)都是棉葉的內(nèi)生真菌定植率最高。其中：茌平的棉葉內(nèi)生真菌定植率最高，為70.00%；曹縣和鄆城棉莖內(nèi)生真菌定植率最低，僅為5.00%。不同地區(qū)同一部位的內(nèi)生真菌定植率比較，茌平的棉葉和棉莖最高，鄆城的棉鈴定植率最高。

2.2 棉花不同部位內(nèi)生真菌組成

在4個(gè)地區(qū)40株棉花的葉、莖、鈴共240個(gè)樣本中共分離出79個(gè)菌株，歸屬于16個(gè)屬，分別為鏈格孢屬Alternaria、鐮刀菌屬Fusarium、分子孢子菌屬Cladosporium、黑孢子菌屬Nigrospora、青霉屬Penicillium、旋孢腔菌屬Cochliobolus、暗球腔菌屬Phaeosphaeria、毛球腔菌屬Setosphaeria、中國炭疽菌屬Colletotrichum、莖點(diǎn)霉屬Phoma、彎孢屬Curvularia、間座殼屬Diaporthe、離蠕孢屬Bipolaris、附球菌屬Epicoccum、Gibellulopsis、白僵菌屬Beauveria，其中鏈格孢屬、鐮刀菌屬、分子孢子菌屬、黑孢子菌屬在棉花葉、莖、鈴中均出現(xiàn)（表2）。

表2 不同部位內(nèi)生真菌的群落組成（菌株數(shù)分類統(tǒng)計(jì)）

濟(jì)陽棉花共分離出22個(gè)菌株，其中棉葉分離出8個(gè)菌株，棉莖分離出7個(gè)菌株，棉鈴分離出7個(gè)菌株，歸屬于9個(gè)屬，分別為鏈格孢屬、鐮刀菌屬、分子孢子菌屬、青霉屬、旋孢腔菌屬、黑孢子菌屬、暗球腔菌屬、毛球腔菌屬、中國炭疽菌屬；茌平棉花共分離出31個(gè)菌株，其中棉葉分離出14個(gè)菌株，棉莖分離出9個(gè)菌株，棉鈴分離出8個(gè)菌株，歸屬于9個(gè)屬，分別為鏈格孢屬、鐮刀菌屬、分子孢子菌屬、莖點(diǎn)霉屬、彎孢屬、間座殼屬、黑孢子菌屬、離蠕孢屬、附球菌屬；曹縣分離出6個(gè)菌株，其中棉葉分離出3個(gè)菌株，棉莖分離出1個(gè)菌株，棉鈴分離出2個(gè)菌株，歸屬于2個(gè)屬，為鏈格孢屬、Gibellu-lopsis；鄆城共分離出20個(gè)菌株，其中棉葉分離出10個(gè)菌株，棉莖分離出1個(gè)菌株，棉鈴分離出9個(gè)菌株，歸屬于5個(gè)屬，分別為鏈格孢屬、鐮刀菌屬、分子孢子菌屬、黑孢子菌屬、白僵菌屬。

2.3 棉花不同部位內(nèi)生真菌的相對分離率

由表3可知，濟(jì)陽棉葉的優(yōu)勢屬為鏈格孢屬和毛球腔菌屬，相對分離率均為37.50%，棉莖的優(yōu)勢屬為鐮刀菌屬，相對分離率為28.55%，棉鈴的優(yōu)勢屬為中國炭疽菌屬，相對分離率為100.00%；茌平棉葉、棉莖、棉鈴的優(yōu)勢屬均為鏈格孢屬，相對分離率分別為57.14%、33.34%、100.00%；曹縣棉葉、棉莖、棉鈴的優(yōu)勢屬均為鏈格孢屬，相對分離率分別為66.67%、100.00%、100.00%；鄆城棉葉、棉莖的優(yōu)勢屬為鏈格孢屬，相對分離率分別為80.00%、100.00%，棉鈴的優(yōu)勢屬為黑孢子菌屬，相對分離率為44.44%。

表3 棉花不同部位內(nèi)生真菌相對分離率%

2.4 棉花不同部位內(nèi)生真菌多樣性

由表4可知，各 地區(qū)葉、莖、鈴 的Shannon-Weaver指數(shù)（H）、Evenness均勻度指數(shù)（E）、Margalet豐富度指數(shù)（R）高低順序不一致。濟(jì)陽棉花不同部位H、E、R的大小順序均為莖＞葉＞鈴；茌平棉花不同部位H、E的大小順序?yàn)槿~＞莖＞鈴，而R的大小順序?yàn)榍o＞葉＞鈴；曹縣棉花不同部位的H、E、R大小順序?yàn)椋喝~＞莖＝鈴；鄆城棉花不同部位的H、E、R大小順序均為鈴＞葉＞莖。

表4 棉花不同部位內(nèi)生真菌多樣性

2.5 棉花不同部位內(nèi)生真菌相似性

由表5中Jaccard相似性系數(shù)（SJ）可知：對于同一地區(qū)棉花不同部位的內(nèi)生真菌，曹縣的葉與莖、鈴中等程度相似，莖與鈴極為相似，鄆城的葉與鈴中等程度相似，其余地區(qū)的各部位都不相似；對于不同地區(qū)棉花同一部位的內(nèi)生真菌，茌平的葉與鄆城的葉中等程度相似，茌平的鈴與曹縣的鈴、曹縣的莖與鄆城的莖極為相似，其余地區(qū)的同一部位不相似；對于不同地區(qū)棉花不同部位的內(nèi)生真菌組成，濟(jì)陽的莖與鄆城的葉和鈴中等程度相似，茌平的鈴與曹縣的葉中等程度相似，與曹縣的莖、鄆城的莖極為相似，曹縣的葉與鄆城的莖中等程度相似，曹縣的鈴與鄆城的莖極為相似。

表5 棉花不同部位內(nèi)生真菌Jaccard相似性系數(shù)（SJ）

3 結(jié)論與討論

通過對4個(gè)地區(qū)棉花的取樣調(diào)查，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌在棉花的不同部位中普遍存在。其中，棉葉的內(nèi)生真菌定植率最高，棉鈴、棉莖定植率因地區(qū)不同大小各有差異。吳曉菡等研究山胡椒不同部位內(nèi)生真菌的組成發(fā)現(xiàn)，莖中內(nèi)生真菌定植率最高，葉中最低[5]，與本研究結(jié)果不一致。這可能與宿主植物不同有關(guān)。本研究4個(gè)地區(qū)共分離出79個(gè)菌株，歸屬于16個(gè)屬，分別為鏈格孢屬、鐮刀菌屬、分子孢子菌屬、青霉屬、旋孢腔菌屬、黑孢子菌屬、暗球腔菌屬、毛球腔菌屬、中國炭疽菌屬、莖點(diǎn)霉屬、彎孢屬、間座殼屬、離蠕孢屬、附球菌屬、Gibellulopsis、白僵菌屬。其中，鏈格孢屬在4個(gè)地區(qū)均出現(xiàn)，鐮刀菌屬、分子孢子菌屬、黑孢子菌屬在3個(gè)地區(qū)均出現(xiàn)，表明這些內(nèi)生真菌沒有區(qū)域?qū)Ｒ恍?，其余?nèi)生真菌均表現(xiàn)出區(qū)域?qū)Ｒ恍浴ｆ湼矜邔?、鐮刀菌屬、分子孢子菌屬、黑孢子菌屬?個(gè)菌屬在棉花葉、莖、鈴3個(gè)部位中均出現(xiàn)，表明這4個(gè)菌屬?zèng)]有組織專一性。有的內(nèi)生真菌表現(xiàn)出不同的器官或組織偏好性，暗球腔菌屬、毛球腔菌屬、離蠕孢屬、附球菌屬、Gibellulopsis只在棉葉出現(xiàn)；莖點(diǎn)霉屬、間座殼屬、青霉屬、旋孢腔菌屬只在棉莖中出現(xiàn)；中國炭疽菌屬、白僵菌屬只在棉鈴出現(xiàn)。鏈格孢屬和鐮刀菌屬是常見的真菌，可侵染多種植物，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，有些可侵染人和動(dòng)物，造成嚴(yán)重的疾??；但也可作為被利用的真菌資源，具有殺蟲、殺菌等作用，有利于動(dòng)植物的生長發(fā)育[17-24]。

同一地區(qū)棉花的不同部位中內(nèi)生真菌種類和數(shù)量具有較大的差異，不同地區(qū)的棉花同一部位中內(nèi)生真菌種類和數(shù)量也不相同。這與吳曉菡等[5]對山胡椒、劉建青[25]對小麥、游見明[26]對茶樹不同部位的研究結(jié)果一致。4個(gè)地區(qū)棉葉的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬均為鏈格孢屬，而不同地區(qū)棉花莖、鈴的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬不同：濟(jì)陽棉莖的為鐮刀菌屬，茌平、曹縣、鄆城棉莖的均為鏈格孢屬；濟(jì)陽棉鈴的為中國炭疽菌屬，茌平棉鈴的為鏈格孢屬，曹縣棉鈴的為鏈格孢屬，鄆城棉鈴的為黑孢子菌屬。

從內(nèi)生真菌的Shannon-Weaver指數(shù)（H）、Evenness均勻度指數(shù)（E）、Margalet豐富度指數(shù)（R）看，4個(gè)地區(qū)棉葉表現(xiàn)出豐富的生物多樣性，濟(jì)陽、茌平的棉莖表現(xiàn)出豐富的生物多樣性，鄆城的棉鈴表現(xiàn)出豐富的生物多樣性。這可能與采樣地點(diǎn)和植株結(jié)構(gòu)有關(guān)。

筆者等曾對不同地區(qū)棉花葉片內(nèi)生真菌做過研究，表明地域?qū)?nèi)生真菌群落組成具有很高的影響[27]。本文對棉花不同部位的研究結(jié)果表明，植物器官對內(nèi)生真菌的分布也具有較大的影響，這可能與各器官的結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征有關(guān)。其他影響因子，例如植物種類、生長階段等對內(nèi)生菌分布的影響，還需進(jìn)一步更全面的研究。