史 影, 王偉偉, 葉伶燕, 周耐明

(浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 310058)

當(dāng)前高校生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的內(nèi)容主要以體外非細(xì)胞體系的檢測性實(shí)驗(yàn)為主,如酶的活性檢測、蛋白質(zhì)濃度測定、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量等等,對于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化及運(yùn)動(dòng)涉及很少。利用G蛋白偶聯(lián)受體內(nèi)吞原理,通過熒光蛋白顯微成像技術(shù),讓學(xué)生觀察并實(shí)踐了受體蛋白在細(xì)胞中的內(nèi)吞過程和回膜運(yùn)動(dòng),同時(shí)還觀察了下游招募蛋白的定位和運(yùn)動(dòng)。該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦€可用于膜受體內(nèi)吞機(jī)制的基礎(chǔ)研究以及受體藥物篩選,是個(gè)值得推廣并便于實(shí)踐的生化實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)原理

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)是一類高度保守的細(xì)胞膜蛋白超家族,廣泛存在于從真菌到哺乳動(dòng)物的生命體中。細(xì)胞外信號通過GPCRs將信息傳遞至細(xì)胞內(nèi)并通過效應(yīng)系統(tǒng)發(fā)揮廣泛調(diào)控作用[1]。GPCRs 與人類疾病如肥胖、糖尿病、骨質(zhì)疏松、腫瘤、炎癥、甚至 HIV 病毒感染等都密切相關(guān),所以 GPCRs一直也是研發(fā)新藥的主要藥靶[2-3]。當(dāng)GPCRs的激動(dòng)劑持續(xù)存在時(shí),會在幾分鐘至幾小時(shí)內(nèi)引起細(xì)胞膜表面的受體數(shù)量降低,即發(fā)生內(nèi)吞(internalization)。隨后,GPCRs會出現(xiàn)反應(yīng)性降低的現(xiàn)象，即受體失敏(desensitization)[4-6]。GPCRs的內(nèi)吞及失敏是調(diào)節(jié)GPCRs介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及效應(yīng)的重要機(jī)制。內(nèi)吞后受體通常有兩種去路,一是通過內(nèi)含體(endosome)再循環(huán)回到細(xì)胞膜表面,完成復(fù)敏;二是被送到溶酶體中發(fā)生不可逆的降解[7]。

GPCRs的內(nèi)吞過程伴隨一系列分子事件。在特定激動(dòng)劑誘導(dǎo)下,GPCRs構(gòu)象發(fā)生改變,構(gòu)象改變后的受體被第二信使依賴的激酶PKA、PKC等或G蛋白偶聯(lián)受體激酶GRKs識別并發(fā)生快速磷酸化。磷酸化后的受體招募β-arrestins從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜。GPCRs與arrestins的結(jié)合引起arrestin構(gòu)象改變,促進(jìn)其C端結(jié)構(gòu)域暴露,暴露的C端結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步與籠型蛋白(clathrin)和籠型蛋白適配器AP-2(adaptor protein complex-2)的β2銜接蛋白亞基(β2-adaptin subunit)發(fā)生相互作用。接著該復(fù)合體通過網(wǎng)格蛋白包被的小窩(clathrin coated pits, CCPs)在dynamin的發(fā)動(dòng)下發(fā)生內(nèi)吞[8-11]。

受體內(nèi)吞模型研究常用綠色熒光蛋白GFP作為重要工具。GFP有2個(gè)吸收峰,主峰在395 nm,次峰在470 nm,其熒光發(fā)射峰在509 nm。GFP的突變體增強(qiáng)型熒光蛋白EGFP(enhanced green fluorescent protein)改善了GFP在37 ℃的折疊能力,顯著提高了GFP的光譜性質(zhì),并大大增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性。突變后的EGFP激發(fā)峰轉(zhuǎn)移至488 nm,而發(fā)射峰仍保持在509 nm,這和常用的FITC濾光片匹配,提高了GFP的應(yīng)用潛力[12-13]。本實(shí)驗(yàn)通過常規(guī)的基因操作,將趨化因子受體FPR1與EGFP在細(xì)胞中融合表達(dá),觀察FPR1的細(xì)胞內(nèi)定位及內(nèi)吞過程,以及對β-arrestins的招募作用。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 質(zhì)粒提取及檢測

實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒為FPR1-pEGFP、PCMV-FPR1、β-arrestin1-pEGFP、β-arrestin2-pEGFP。將所用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中,搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)。用去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒提取相關(guān)質(zhì)粒,用紫外分光光度法對所提質(zhì)粒進(jìn)行定性定量分析。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株為人胚胎腎細(xì)胞HEK293,用含10%FBS的DMEM/Low Glucose培養(yǎng)基,在37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80～90%時(shí),以1∶3～1∶5的稀釋度傳代。

2.3 轉(zhuǎn)染

將處于良好生長狀態(tài)的HEK293細(xì)胞,以3×105～5×105的密度接種于6孔培養(yǎng)板中。在37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h,待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí),選用Lipofectamine 2 000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)4～6 h換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)8～12 h。

教師推薦轉(zhuǎn)染方案,6孔板中的其中2孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染FPR1-pEGFP,用于直接觀察FPR1-GFP受體蛋白的內(nèi)吞,2孔細(xì)胞共轉(zhuǎn)染PCMV-FPR1和β-arrestin1-pEGFP,另兩孔細(xì)胞共轉(zhuǎn)染PCMV-FPR1和β-arrestin2-pEGFP,后四孔細(xì)胞用于觀察FPR1被配體激活后輔助蛋白β-arrestins的動(dòng)態(tài)變化。學(xué)生可根據(jù)自己的設(shè)計(jì)調(diào)整方案。

2.4 受體定位及內(nèi)吞研究

2.4.1 細(xì)胞準(zhǔn)備

將6孔板中轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞,平均分配于事先置有滅菌蓋玻片的6孔板中,讓細(xì)胞在蓋玻片上生長。37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h,使在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天細(xì)胞達(dá)到70%～80%的匯合度。其中2孔提前加入蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮過夜培養(yǎng)。

2.4.2 激動(dòng)劑刺激和細(xì)胞固定

加5 μM FPR1激動(dòng)劑fMLP于FPR1-pEGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分別孵育0、5、30、45 min,用于觀察激動(dòng)劑處理不同時(shí)間受體蛋白的定位及內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)；配制不同濃度的激動(dòng)劑fMLP(用DMEM稀釋),作用于FPR1-pEGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞,于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min,用于觀察不同濃度激動(dòng)劑對FPR1受體內(nèi)吞的影響；在放線菌酮處理的細(xì)胞中加入激動(dòng)劑刺激45 min,再去除激動(dòng)劑,1 h后觀察受體蛋白的去路。

在PCMV-FPR1和β-arrestin1-pEGFP, PCMV-FPR1和β-arrestin2-pEGFP 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中,加入激動(dòng)劑fMLP,作用不同時(shí)間,觀察β-arrestin1和β-arrestin2的定位及變化。

孵育完畢后將細(xì)胞培養(yǎng)基從待檢細(xì)胞中吸出, 用PBS 漂洗細(xì)胞。漂洗后, 4%多聚甲醛室溫固定10 min,將玻片從6孔板中取出,置于事先滴有甘油的蓋玻片上,封片。

2.4.3 細(xì)胞定位及內(nèi)吞觀察

熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡下觀測綠色熒光蛋白的分布。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

3.1 觀察激動(dòng)劑作用不同時(shí)間FPR1從細(xì)胞膜到胞漿的內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)

用FPR1激動(dòng)劑fMLP(5 μM)刺激轉(zhuǎn)染有FPR1-pEGFP的細(xì)胞,37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育0、5、30、45 min,熒光顯微鏡或confocal觀察FPR1-pEGFP融合蛋白的定位。結(jié)果如圖1所示,0 min即不加激動(dòng)劑時(shí),受體蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞膜上；5 min時(shí)部分受體蛋白已形成顆粒狀向細(xì)胞內(nèi)遷移即內(nèi)吞,但細(xì)胞膜上還存有部分受體蛋白；30 min時(shí),內(nèi)吞顆粒增加且進(jìn)入細(xì)胞更內(nèi)部；45 min后絕大部分受體蛋白集中在胞漿某一區(qū)域,細(xì)胞膜上基本看不到受體蛋白。圖1中清楚地展示了膜受體蛋白的內(nèi)吞過程。

圖1 激動(dòng)劑處理不同時(shí)間的FPR1-pEGFP內(nèi)吞

3.2 觀察不同濃度激動(dòng)劑作用于FPR1后,引起的FPR1受體內(nèi)吞

用不同濃度(1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L)的FPR1激動(dòng)劑fMLP刺激轉(zhuǎn)染有FPR1-pEGFP的細(xì)胞,37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min,熒光顯微鏡或confocal觀察FPR1-pEGFP融合蛋白的定位。結(jié)果如圖2所示,在低濃度10 nmol/L激動(dòng)劑刺激下,受體蛋白基本沒有內(nèi)吞,在100 nmol/L時(shí)有部分內(nèi)吞,1 μmol/L時(shí)幾乎全部內(nèi)吞。由此理解受體蛋白內(nèi)吞數(shù)量與激動(dòng)劑濃度正相關(guān)的內(nèi)在機(jī)制。

圖2 不同濃度激動(dòng)劑處理下FPR1-pEGFP的內(nèi)吞

3.3 觀察FPR1受體內(nèi)吞后,撤去激動(dòng)劑1 h后受體蛋白的去路

內(nèi)吞后的受體通常有2條去路,到溶酶體中被降解或重新回到膜上發(fā)揮功能。具體采用哪條去路與受體的性質(zhì)有關(guān)。在用放線菌酮預(yù)處理細(xì)胞,抑制新受體蛋白合成的情況下,激動(dòng)劑刺激45 min使受體內(nèi)吞,然后換液撤去激動(dòng)劑,1 h后發(fā)現(xiàn)內(nèi)吞的FPR1重新回到細(xì)胞膜上,說明內(nèi)吞后的FPR1受體會重新回到細(xì)胞膜再循環(huán)使用，見圖3所示。

圖3 FPR1受體內(nèi)吞后去路觀察

3.4 觀察FPR1受體內(nèi)吞過程中,β-arrestin1和β-arrestin2的運(yùn)動(dòng)變化

將PCMV-FPR1和β-arrestin1-pEGFP, PCMV-FPR1和β-arrestin2-pEGFP 分別共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,加激動(dòng)劑fMLP作用不同時(shí)間,結(jié)果如圖4所示。在0 min即不加激動(dòng)劑時(shí),β-arrestin1和β-arrestin2主要分布在胞漿中,激動(dòng)劑加入1 min時(shí)β-arrestin1已向細(xì)胞膜分布,到5 min時(shí)細(xì)胞膜定位更明顯,隨著時(shí)間的延長,到15 min時(shí),β-arrestin1重新回到胞漿；在激動(dòng)劑處理過程中β-arrestin2也出現(xiàn)了胞漿-細(xì)胞膜-胞漿的運(yùn)動(dòng)過程,1 min時(shí)細(xì)胞膜定位最明顯,5 min時(shí)已向胞漿遷移。該實(shí)驗(yàn)反映了β-arrestin1和β-arrestin2蛋白都參與了FPR1受體內(nèi)吞過程,且并不完全同步,相關(guān)機(jī)制還可設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步研究。

圖4 FPR1受體內(nèi)吞過程中β-arrestin1和β-arrestin2的招募

4 實(shí)驗(yàn)安排及效果

本實(shí)驗(yàn)安排在高級生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中,可連續(xù)4～5 d,共12～18 h。中間設(shè)置開放環(huán)節(jié),如激動(dòng)劑濃度選擇,處理時(shí)間選擇,對照設(shè)置,FPR1與其他下游蛋白的相互作用等,或者學(xué)生其他感興趣的環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)過程強(qiáng)調(diào)直觀現(xiàn)象與分子機(jī)制的契合理解,實(shí)驗(yàn)對照組的設(shè)置,拓展性實(shí)驗(yàn)的思考,并學(xué)習(xí)正確的熒光蛋白顯微成像技術(shù)。多年教學(xué)實(shí)踐顯示該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容豐富、綜合性強(qiáng)、學(xué)生學(xué)習(xí)積極性高。

5 結(jié)語

當(dāng)前熒光蛋白技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)空間定位和轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白折疊、生物分子相互作用等研究領(lǐng)域[14-15]。在本科生高級生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中,我們用綠色熒光蛋白EGFP作標(biāo)記,在熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察G蛋白偶聯(lián)受體FPR1的定位和內(nèi)吞運(yùn)動(dòng),以及其下游蛋白β-arrestins的招募過程。該實(shí)驗(yàn)一方面使學(xué)生觀察到不同條件及動(dòng)態(tài)變化中蛋白質(zhì)的定位及運(yùn)動(dòng)；另一方面,在具體實(shí)驗(yàn)中也學(xué)習(xí)了相應(yīng)的蛋白顯微成像技術(shù)及圖像處理方法,拓展了生物化學(xué)的本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。另外,由于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常直觀,也有效地調(diào)動(dòng)了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)積極性和興趣。該實(shí)驗(yàn)對學(xué)生進(jìn)一步認(rèn)識蛋白質(zhì)在信號刺激及系列分子事件中的運(yùn)動(dòng)及相關(guān)機(jī)制起到了很好的啟示作用。