陳炯，馮巍，詹飛

河南科技大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023

在性犯罪案件中，從受害人處收集的檢材多是來自受害者和施暴者各種細(xì)胞和體液的混合物 (混合斑)[1-3]。此類案件中，精液或精斑作為重要的法醫(yī)物證檢材，通常伴隨受害者的生物樣本成分的存在。為了確認(rèn)罪犯，法醫(yī)學(xué)者嘗試將混合物中的男性和女性細(xì)胞分離以獲取嫌疑人的DNA圖譜。根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)、大小、比重及膜成分差異等，人們建立了從含有陰道上皮細(xì)胞的混合物中分離精子的多種方法，包括差異裂解法、濾膜法、激光捕獲顯微切割法和流式細(xì)胞分選法等[4-7]。差異裂解法是從陰道拭子中分離精子DNA的傳統(tǒng)方法。該方法利用精子和上皮細(xì)胞外膜特性的不同，將精子DNA與體細(xì)胞分離。此法的缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)且自動(dòng)化程度低[8]。激光捕獲顯微切割法實(shí)現(xiàn)了精子與上皮細(xì)胞的精準(zhǔn)分離，但成本昂貴，難以普及[9-10]。此外，基于上皮細(xì)胞與精子沉降速率的差異，Horsman等研發(fā)了微流控芯片技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了精子的快速分離，但該裝置工藝復(fù)雜，只適用于少數(shù)細(xì)胞類型的分離[11-12]。因此，建立一種簡(jiǎn)便高效的精子分離方法仍是法醫(yī)學(xué)急需解決的難題。

近年來，利用針對(duì)精子特異性蛋白的抗體結(jié)合免疫磁珠 (IMB) 技術(shù)，為精子分離提供了一種可供選擇的方法。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)利用精子運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域蛋白3 (MOSPD3) 抗體包被的磁珠可分離混合細(xì)胞中的精子，在精子濃度 ≥105/mL時(shí)，可獲得完整的男性DNA圖譜。Zhao等[14]用抗精子特異性透明質(zhì)酸酶 (PH-20) 抗體制備IMB，在混合物中精子/上皮細(xì)胞比例為103∶105時(shí)成功分離出精細(xì)胞。IMB法用于混合斑檢驗(yàn)，依賴于與精子頭部抗原特異性結(jié)合的抗體，因此尋找合適的抗體成為必由之路。人載脂蛋白6 (Human lipocalin 6，hLCN6) 是新發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白家族成員，它由附睪分泌且能與精子結(jié)合，與精子的成熟有關(guān)[15]。用RNA 干擾的方法將大鼠體內(nèi)載脂蛋白6 (rLcn6) 的表達(dá)抑制后，精子的活力降至原來的10%以下 (結(jié)果未發(fā)表)。雖然hLCN6與精子相互作用的分子機(jī)制尚不清楚，但根據(jù)其在精子上呈現(xiàn)的離散型斑點(diǎn)狀分布模式，人們推斷hLCN6極有可能是通過和精子表面特異性受體之間的相互作用而結(jié)合到精子上。hLCN6因其在附睪中的特異表達(dá)及所具有的生物功能在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到重視，而hLCN6能夠與精細(xì)胞結(jié)合的特性，使其作為特異性生物標(biāo)記用于法醫(yī)學(xué)精細(xì)胞鑒定以及混合斑中精細(xì)胞的分離成為可能。本實(shí)驗(yàn)室曾以原核表達(dá)純化的hLCN6蛋白為抗原，成功獲得了抗hLCN6單克隆抗體 (anti-hLCN6 mAb)[16]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步將抗體偶聯(lián)到IMB上，以期分離捕獲混合細(xì)胞中的精子，嘗試建立混合細(xì)胞體系內(nèi)精子分離的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

按照知情同意的原則，實(shí)驗(yàn)用精液樣本及女性口腔上皮細(xì)胞樣本，分別由本實(shí)驗(yàn)室10名健康成年男性和10名女性志愿者提供。蛋白酶K和二硫蘇糖醇 (DTT) 購(gòu)自TaKaRa公司；QIAamp DNA微量提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；AmpFlSTR Identifiler Plus PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司；膜蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovision公司；Sulfo-NHS-LC-Biotin、BCA蛋白定量試劑盒和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物 (ECL) 購(gòu)自Pierce公司；透析袋購(gòu)自美國(guó)Viskase公司；Dynabeads FlowComp Flexi試劑盒與RNase-free DNase Ⅰ購(gòu)自Thermo Fisher公司；鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白 (β-actin)mAb購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和Dylight 488熒光標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)自武漢博士德公司；Prolong抗熒光衰減封片劑購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；其余各種化學(xué)試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

Centrifuge 5810R型低溫冷凍高速離心機(jī)和Thermomixer comfort恒溫混勻儀購(gòu)自Eppendorf公司；OmegaLum G型凝膠成像分析儀購(gòu)自美國(guó)Aplegen公司；Sunrise型96孔酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN公司；3130XL遺傳分析儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；MagneSphere磁分離架購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 抗hLCN6 mAb親和力的測(cè)定

利用間接ELISA法測(cè)定抗hLCN6 mAb的親和力，以1 μg/mL重組蛋白His-hLCN6包被酶標(biāo)板，封閉后加入倍比稀釋的mAb，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，酶標(biāo)儀讀取OD450吸光值。當(dāng)連續(xù)幾個(gè)稀釋度的OD450讀數(shù)不再增大時(shí)視為抗原抗體100%結(jié)合，以抗體濃度 (mol/L) 為橫坐標(biāo)，OD450吸光值為縱坐標(biāo)做散點(diǎn)圖，生成對(duì)數(shù)趨勢(shì)線和公式。將OD450最大值的一半代入公式，求出此時(shí)的抗體濃度即為mAb的親和力解離常數(shù) (Kd)[17-18]。

1.3 精子與口腔上皮細(xì)胞混合懸液及混合斑的制備

精液在射精后30 min內(nèi)經(jīng)PBS洗滌3次去除精漿及其他成分，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)確定單位體積內(nèi)精子數(shù)量，以PBS緩沖液倍數(shù)稀釋，分別配制成精子數(shù)為103/mL、104/mL、105/mL的3組懸液。取女性志愿者口腔拭子，用PBS緩沖液洗脫后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，制成104/mL的上皮細(xì)胞懸液。同時(shí)取每位志愿者血樣作為DNA分型對(duì)照樣本。

取1 mL上皮細(xì)胞懸液加入到l mL已制備的不同數(shù)目的精子懸液中混勻，8 000 r/min離心5 min后棄上清，制成含約104個(gè)上皮細(xì)胞、精子數(shù)分別為103、104、105個(gè)的混合懸液 (1 mL) 3組各10份備檢。同法配制上述混懸液各1 mL，8 000 r/min離心5 min后棄上清液，沉淀加50 μL PBS重懸后滴于紗布上模擬制作混合斑。

1.4 免疫印跡檢測(cè)

取精子 (105/mL) 和口腔上皮細(xì)胞 (104/mL)懸液各10份，用膜蛋白提取試劑盒提取精子細(xì)胞膜蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，每份樣品取等量 (80 μg) 進(jìn)行SDS-PAGE，200 mA恒電流轉(zhuǎn)膜1 h。含5%脫脂奶粉的PBST溶液 (含0.05% Tween-20的PBS緩沖液) 37 ℃封閉1 h，加hLCN6 mAb (1∶ 2 0 000稀釋) 37 ℃孵育1 h，加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶5 000稀釋) 37 ℃孵育1 h，ECL顯色后進(jìn)行成像分析。用β-actin作為內(nèi)參。

1.5 免疫熒光檢測(cè)

將冷凍保存的精子用PBS洗滌，2%多聚甲醛固定15 min后，將精子在含50 mmol/L甘氨酸的PBS中洗滌3次，沉淀重懸于PBS中，調(diào)至107/mL。取1滴細(xì)胞懸液做涂片，–20 ℃凍存。染色當(dāng)天，將精子在PBS中再水化15 min，用含4%山羊血清的PBS封閉15 min。將精子與1∶500稀釋的抗hLCN6 mAb孵育1 h。經(jīng)PBS洗滌后加入1∶500稀釋的熒光標(biāo)記二抗，室溫孵育60 min，洗滌后用抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。用免疫前小鼠IgG作為對(duì)照。在光鏡下(400×)，隨機(jī)選取6個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均陽(yáng)性率[19]。

1.6 IMB分離混合細(xì)胞中的精子

1.6.1 hLCN6抗體的生物素標(biāo)記

向hLCN6 mAb (5 mg/mL) 中加入Sulfo-NHSLC-Biotin，按試劑盒說明書的操作步驟，4 ℃反應(yīng)72 h，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到透析袋中，加PBS緩沖液 (1 L) 4 ℃透析過夜。

1.6.2 精子細(xì)胞的捕獲與分離

向制備好的精子與上皮細(xì)胞混合液 (混合斑使用前用PBS洗脫細(xì)胞) 中加入2 μL生物素標(biāo)記的抗體，置于恒溫混勻儀上，37 ℃、800 r/min孵育1 h，2 000 r/min離心8 min，棄上清后沉淀用500 μL PBS洗滌3遍。用100 μL PBS重懸細(xì)胞，并加入20 μL鏈酶親和素包被的磁珠，5 ℃、30 r/min孵育15 min。將抗體和IMB的懸液用磁分離架吸附5 min，吸棄上清后加入200 μL預(yù)冷PBS洗滌3次，取2 μL懸液涂片鏡檢；用磁分離架吸附5 min，吸棄上清后加入500 μL洗脫緩沖液洗脫并回收精子，后用DNaseⅠ處理樣品去除女性DNA (具體參照說明書)。

1.7 差異裂解法

按GA/T383 2002差異裂解法，提取1.3中制備的另一組混合懸液或混合斑，第一步消化后回收精子。

1.8 DNA提取、擴(kuò)增及檢測(cè)

將志愿者血樣以及上述回收的精子按QIAamp DNA微量提取試劑盒操作步驟分別提取DNA，應(yīng)用Identifiler Plus試劑盒進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用3130XL遺傳分析儀進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)果用GeneMapper ID v3.2軟件分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以志愿者血樣的DNA分型作為參考，計(jì)算IMB分離法及差異裂解法得到的單一男性分型個(gè)數(shù)，同時(shí)統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本正確分型的基因座數(shù)，以正確分型13個(gè)以上、基因座峰值在200相對(duì)熒光單位 (Relative fluorescence units, RFU) 以上為檢測(cè)成功。對(duì)兩種方法的結(jié)果采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗hLCN6 mAb親和力的測(cè)定

利用間接ELISA 方法測(cè)定抗hLCN6 mAb的親和力，結(jié)果表明該抗體與抗原的親和力解離常數(shù) (Kd) 為3.47×10–9mol/L (圖1)。

2.2 hLCN6在精子及上皮細(xì)胞中的免疫印跡分析

采用Western blotting對(duì)不同個(gè)體的精子細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，各樣本均檢出hLCN6蛋白，分子量約為16 kDa，與蛋白已知分子量相一致。而口腔上皮細(xì)胞中無hLCN6蛋白的表達(dá) (圖2)。

圖1 抗hLCN6 mAb親和力測(cè)定Fig.1 Affinity assay of anti-hLCN6 mAb.

圖2 Western blotting檢測(cè)hLCN6在精子及口腔上皮細(xì)胞的表達(dá)Fig.2 Western blotting analysis of hLCN6 expression in spermatozoa and buccal epithelial cells.1: buccal epithelial cells; 2: spermatozoa.

2.3 hLCN6的精細(xì)胞定位

用純化的抗hLCN6 mAb對(duì)精子進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示，在精子頭部的頂體后區(qū)域出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào) (圖3)，證明hLCN6蛋白主要分布在精子頭部，這與之前文獻(xiàn)報(bào)道一致。與hLCN6蛋白結(jié)合的精子陽(yáng)性率為(90±5)% (n=6)。而對(duì)照抗體染色的精細(xì)胞頭部為陰性。

2.4 Anti-hLCN6 IMBs捕獲精子情況

將生物素標(biāo)記的抗hLCN6 mAb包被IMBs，與細(xì)胞混合懸液進(jìn)行孵育，充分洗滌后將樣品制備成涂片進(jìn)行顯微觀察。顯微鏡下見精子結(jié)構(gòu)完整，每個(gè)精子可結(jié)合多個(gè)磁珠，主要結(jié)合在精子頭部 (圖4)。鏡下未檢測(cè)到口腔上皮細(xì)胞。

圖3 抗hLCN6 mAb的免疫熒光染色分析Fig.3 Immunofluorescence analysis of anti-hLCN6 mAb staining in sperm cells.(A) Immunofluorescent staining of spermatozoa with anti-hLCN6 mAb.(B)Control immunofluorescent staining of spermatozoa with normal mouse IgG.(C, D) Sperm cells observed under a light microscope.

圖4 顯微鏡觀察anti-hLCN6 IMBs捕獲精子情況Fig.4 Optical microscopy image for intact (A) and tail-lost sperm cell (B) captured by anti-hLCN6 IMBs (400×).

2.5 IMB法和差異裂解法分離精子DNA分型檢測(cè)情況

圖5 混合細(xì)胞懸液中精子分離的STR分型檢測(cè)結(jié)果Fig.5 STR typing of spermatozoa isolated from mixed cell suspensions.Sperm cells were separated with common differential lysis (A) and anti-hLCN6 mAb IMBs-based method (B).Female epithelial cell and sperm concentrations were 104/mL and 103/mL, respectively.

為了檢測(cè)anti-hLCN6 IMBs分離精子的效率和靈敏度，制備了一系列不同比例的精子-上皮細(xì)胞混合懸液和混合斑，分別用IMB法和差異裂解法對(duì)樣品中的精子進(jìn)行分離回收，提取精子DNA后進(jìn)行PCR-STR分型檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。當(dāng)混合細(xì)胞中精子數(shù)量為103/mL時(shí)，10份樣品中9份得到成功分型，成功率為90%，而差異裂解法分型成功率僅為40%，兩者具有顯著差異 (P<0.05，圖5，表1)。精子細(xì)胞數(shù)為104/mL和105/mL時(shí)，IMB法檢測(cè)的單一男性13個(gè)STR基因座的正確分型率均為100%，兩種檢測(cè)方法成功率無明顯差異 (P>0.05)。不同數(shù)量的精子 (103/mL、104/mL、105/mL)與上皮細(xì)胞混懸液制作的混合斑中，IMB法檢測(cè)的各組樣本13個(gè)STR基因座的單一男性正確分型率分別為40%、90%和100%，每組的10份樣品中分別有0、4、10份樣品獲得了單一男性16個(gè)STR基因座的正確分型 (表2)。對(duì)于相同精子數(shù)量的混合懸液及混合斑，IMB法的STR檢出率均高于差異裂解法 (表1、2)。

表1 不同精子數(shù)的細(xì)胞混懸液中精子DNA的STR基因座檢出數(shù)Table 1 Number of STR loci successfully amplified from cell mixture suspensions with different sperm cells number

表2 不同精子數(shù)的模擬混合斑中精子DNA的STR基因座檢出數(shù)Table 2 Number of STR loci successfully amplified from simulated mixed stains with different sperm cells number

3 討論

由精液和陰道分泌液組成的混合斑是性侵案件中最常見的生物學(xué)檢材，如何從男女混合成分中分離出單一男性成分并進(jìn)行DNA分型，是法醫(yī)物證檢驗(yàn)中急需解決的難題[20-21]。近年來，IMB技術(shù)憑借其快速、簡(jiǎn)單、高效等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究，包括微生物的免疫檢測(cè)、腫瘤細(xì)胞分選以及生物大分子的分離純化等[22-23]。法醫(yī)學(xué)家也嘗試將該方法用于混合斑中精子的分離檢測(cè)并取得了良好的結(jié)果。Arthur等[24]用MHS-10、NUH-2、HS-21三種抗體分別與磁珠偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了精子的特異性捕獲，其中MHS-10磁珠的捕獲率最高。Anslinger等[25]針對(duì)精子表面血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (tACE) 抗原篩選抗體制備免疫磁珠，其中4E3抗體捕獲效果最好，對(duì)含有106個(gè)精子的混合斑捕獲效率接近100%。張爾力等[26]選用一種人類精子膜抗原對(duì)應(yīng)的抗體——抗ADAM2制備免疫磁珠，對(duì)混合樣本進(jìn)行分離。結(jié)果顯示在精子含量為103/mL時(shí)的分離成功率為70%。李學(xué)博等[27]利用精子特異性抗體SPAG8結(jié)合免疫磁珠技術(shù)分離混合細(xì)胞系中的精子，建立混合斑中精子細(xì)胞分離的新方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該法用于混合細(xì)胞懸液中精子的分離效果明顯好于混合斑。

已往的文獻(xiàn)報(bào)道均是選用精子自身抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合從而進(jìn)行分離，本研究是利用附睪特異性分泌蛋白hLCN6與精子結(jié)合，再用抗hLCN6單克隆抗體與之結(jié)合進(jìn)而分離。前期研究中，利用抗hLCN6多克隆抗體證實(shí)該蛋白在附睪組織表達(dá)并分泌后結(jié)合到精子上，可能與精子成熟有關(guān)。本研究采用制備的抗hLCN6 mAb進(jìn)行Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，精子細(xì)胞中存在hLCN6蛋白，而上皮細(xì)胞中hLCN6表達(dá)呈陰性。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，hLCN6蛋白大量分布于精子細(xì)胞表面，且以精子頭部的頂體后區(qū)域濃度最高，這將有利于IMB的結(jié)合。顯微鏡下可見精子頭部與IMBs的結(jié)合，證明了抗hLCN6 mAb結(jié)合的有效性。

本實(shí)驗(yàn)制備的anti-hLCN6 IMBs能夠?qū)⒕訌幕旌霞?xì)胞懸液中分離出來，實(shí)驗(yàn)顯示在精子數(shù)量為103/mL時(shí)的分型成功率達(dá)90%，明顯高于差異裂解法 (40%)。這可能是由于當(dāng)精子含量較少時(shí)，差異裂解法兩步消化造成精子細(xì)胞損失所致。而當(dāng)精子濃度≥104/mL時(shí)，所有樣品均可得到單一男性分型。

IMB法對(duì)模擬混合斑中精子DNA的檢驗(yàn)結(jié)果顯示，精子數(shù)為103/mL、104/mL、105/mL的混合斑，各組樣本分型成功率以及16個(gè)STR位點(diǎn)檢出率均高于差異裂解法。在精子數(shù)相同情況下，模擬混合斑的分型成功率低于混懸液，這可能是由于混合斑中的精子在被干燥和從紗布上洗脫時(shí)，細(xì)胞發(fā)生破裂導(dǎo)致表面抗原數(shù)量減少[28]，影響了磁珠的結(jié)合效率所導(dǎo)致。鑒于一些上皮細(xì)胞可能在精子分離前被破壞，釋放的女性DNA附著在IMB-精子復(fù)合物表面導(dǎo)致出現(xiàn)混合圖譜(圖5)，因此我們?cè)谔崛【覦NA前，將IMB-精子復(fù)合物與DNaseⅠ進(jìn)行孵育以消除外源DNA的污染。

綜上，我們首次成功利用附睪特異性分泌的能與精子結(jié)合的蛋白進(jìn)行了精子分離，建立了基于anti-hLCN6 IMBs的混合斑中精子分離的新方法。該方法簡(jiǎn)單高效，其分型成功率高于傳統(tǒng)的差異裂解法，可解決目前精子分離中的特異性差和體細(xì)胞DNA污染等問題，不僅為性侵案件中法醫(yī)學(xué)鑒別并分離精細(xì)胞及后續(xù)的個(gè)體識(shí)別提供新方法，而且為依據(jù)抗原-抗體反應(yīng)分離混合斑中的精細(xì)胞開辟新途徑。此項(xiàng)技術(shù)可作為性侵案件中法醫(yī)混合斑檢驗(yàn)的有效補(bǔ)充手段，對(duì)法醫(yī)物證檢案具有一定的實(shí)用價(jià)值。