姜文倩，田亞茸，左銳，林峻

1 福州大學 應用基因組學研究所，福建 福州 350108

2 哥德堡大學 生物醫(yī)藥研究所感染性疾病中心，瑞典 哥德堡 40530

3 福建醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，福建 福州 350122

4 福州大學 生物科學與工程學院，福建 福州 350108

細胞是生命的基本單位，大多數生命體都是多細胞生物。過去，由于技術的限制，研究者對細胞的研究僅處于多細胞層面。多細胞研究假設培養(yǎng)皿中所有的細胞在培養(yǎng)過程中都相同，科學家們只是在放大信號。但這并不總是正確的，分子水平上的細微差別可能導致細胞行為的顯著變化。

近年來，基于對多細胞DNA、RNA以及蛋白質的研究，科學家們對各種物種有了深刻的了解。但研究多細胞對理解細胞的多樣性存在一定的局限性。每個細胞都是獨一無二的，不僅腫瘤細胞存在異質性，人體正常細胞間也存在異質性[1-4]，甚至在同一個體中，不同單細胞都有其獨特的基因組。多細胞研究的結果僅體現出這些多細胞的總體情況，而不能體現單個細胞之間的差異。單個體細胞基因組的變異，諸如單核苷酸變異(SNVs)、拷貝數變異 (CNVs) 和結構變異，可能導致癌癥及其他疾病的產生[5-7]。

為了打破多細胞研究的局限性，人們越來越關注單細胞研究。單細胞研究有助于我們研究癌癥等相關疾病。無論是增殖或休眠的腫瘤組織，單個細胞都是支配癌癥生物學各方面的決定因素[8]。對腫瘤組織單細胞水平的分析能了解腫瘤內遺傳異質性對癌癥的發(fā)展和治療所產生的影響[9]，能夠讓我們對疾病有更加深入的了解，從而制定更為有效的治療對策。此外，法醫(yī)學通常只有少量的材料可供分析，而能從少量的材料中獲得結果則得益于先進的單細胞技術[10]?；赑CR反應的短串聯(lián)重復序列 (Short tandem repeat，STR) 分型是法醫(yī)鑒定的有力工具。而基于液滴微流體技術的單細胞STR分型技術，具有高靈敏度、高通量和高保真度，該技術在分析不同細胞材料時，對保持單一基因組的完整性十分有效[11]。在臨床生殖醫(yī)學方面，人卵母細胞的單細胞基因組分析對于減數分裂研究和植入前基因組篩查非常重要。基于多重退火環(huán)狀循環(huán)擴增 (Multiple annealing and looping based amplification cycles, MALBAC) 的體外受精植入前基因組篩查可以精確和經濟地選擇出可用于胚胎移植的正常受精卵[12]。

隨著人們對單細胞研究的深入，單細胞基因組學、單細胞轉錄組學和單細胞蛋白質組學正經歷著突飛猛進的發(fā)展[13]。雖然單細胞研究與多細胞研究相比具有多種優(yōu)勢，但存在單細胞挑取和單細胞基因組擴增等難題。文中將從單細胞挑取、單細胞DNA分析、單細胞RNA分析、單細胞蛋白質分析等方面介紹單細胞研究現狀。

1 單細胞分離技術

單細胞分離是單細胞分析的主要難點之一。文中將主要介紹以下3種單細胞分離技術。

1.1 顯微移液法

常見的顯微移液法可以在非常簡單的實驗條件下進行，例如用胰酶將培養(yǎng)細胞或者組織中的細胞消化，形成分散的單細胞，將細胞稀釋至一定比例 (例如約500個單細胞均勻分布在10 cm細胞培養(yǎng)皿中)，在顯微鏡下尋找單細胞，并用移液器吸取單細胞。除了上述方法，還能借助克隆環(huán)[14]挑取單細胞。先制備一個含有單克隆的平板，在顯微鏡下找到滿意的單克隆并標記，用鑷子將克隆環(huán)輕放至標記處并滴加胰酶消化，待細胞變圓后，用移液器吸取單細胞[15]。手工挑取單細胞對操作者、操作環(huán)境都有較高的要求，并且在吸液時容易吸到多個細胞，可能因操作不當導致細胞破裂，但因其操作簡便、成本低廉，是實驗室分離單細胞最常用的技術。

1.2 激光捕獲顯微切割 (Laser capture microdissection, LCM)

激光捕獲顯微切割 (LCM) 是一種通過顯微鏡尋找感興趣的細胞，利用激光從非均一組織切片或活細胞培養(yǎng)中分離高純度細胞群或單細胞的技術[16-18]。LCM一般分為兩類：紅外 (IR) 捕獲系統(tǒng)[16-17,19-20]和紫外 (UV) 切割系統(tǒng)[21-22]。目前，主要有4種類型的激光顯微切割儀，工作原理各異。

最早問世的激光顯微切割儀基于紅外 (IR)捕獲系統(tǒng)和紫外 (UV) 切割系統(tǒng)。紅外激光捕獲感興趣的細胞，紫外激光能顯微切割所捕獲的細胞。其工作原理為：首先，在倒置顯微鏡下找到感興趣的細胞，將熱塑性聚合物薄膜放在組織切片感興趣的細胞上；操作者使用激光脈沖激活熱塑性聚合物薄膜，使薄膜熔化并包圍感興趣的細胞；所形成的聚合物細胞復合物易從組織中轉移出來，并用提取緩沖液溶解聚合物膜釋放感興趣的細胞[16-18]。

其余3種激光顯微切割儀都是采用紫外激光系統(tǒng)，它們各有特色。其中一種依賴重力的激光顯微切割儀，其特點在于不移動樣品，而是移動激光。在正置顯微鏡下找到目標細胞后，使用高精度光學部件將激光束沿著棱鏡上的期望切割線引導到組織上，切割目標區(qū)域，目標細胞將通過重力掉落到收集管中[23-24]。由于不接觸樣品，能使污染風險降到最低。另一種激光顯微切割儀基于光壓反彈分離系統(tǒng)。在倒置顯微鏡下找到目標細胞，利用高精度聚焦激光束切割樣品后，發(fā)射一個激光脈沖，利用激光將目標細胞彈射至收集器中。該激光顯微切割儀也不接觸樣品，能夠快速、無污染地分離目的細胞。最后一種激光顯微切割儀的特點在于樣品的制備。樣品被放置在MembraneSlide上，MembraneSlide是覆蓋一層惰性薄膜的玻片，該薄膜有可以忽略不計的自體熒光；然后，將membraneslide倒置于載玻片上以防止污染。固態(tài)紫外激光器發(fā)射的紫外激光經聚焦透鏡聚焦，在經偏振光合束器合成一束后進入相差顯微鏡，電腦控制玻片移動切割樣品，切割下來的目的細胞可附著在具有黏性的分離帽上[25]。加入溶解緩沖液，管子倒置約10 min。細胞將處于懸浮狀態(tài)，可以進行下游處理。

激光捕獲顯微切割 (LCM) 能分離研究人員感興趣的特定細胞，而不污染周邊細胞[16-17,26]。LCM操作簡便，能精準分離目的細胞，但顯微和激光設備成本較高，而且通過LCM獲得的單細胞基因組測序數據質量一直比較差[27]。LCM的另一個缺陷是，對于組織樣品，常常需要切片后才能在顯微鏡下觀察，但是切片過程常常會在縱向上把一個細胞切成好幾塊薄層，我們用LCM得到的單細胞，常常只是單細胞的一個薄層而已，會缺失很多亞細胞定位特異性的物質；同時，染色體也有可能在切片時被切斷，導致DNA分析出現偏差。

1.3 微流體技術

微流體技術是指在微米級別下操縱流體的技術，常用于需要對流體進行操作的生物實驗。微流體輔助細胞篩選 (MACS) 通過向液流通道中注入細胞，并以逐漸壓縮通道高度的方式工作以實現單細胞分離[13,28]。

基于微流體技術工作的單細胞自動制備系統(tǒng)能在微流體芯片 (Integrated fluidic circuit,IFC) 中將單細胞分離至個體反應室中，并用于mRNA測序、DNA測序、表觀遺傳學或miRNA表達等下游分析。使用該系統(tǒng)制備單細胞的核心過程主要包括5個步驟：首先，對于固體組織或貼壁細胞培養(yǎng)，需要適當的消化，而流體組織或懸浮細胞培養(yǎng)需要亞群富集；進一步富集細胞；之后，需要進一步富集和染色細胞；然后在使用該系統(tǒng)之前進行質量控制；最后可以通過微流體分離單個細胞。與顯微移液法和激光捕獲顯微切割 (LCM) 分離單細胞相比，單細胞自動制備系統(tǒng)對操作者技術要求不高、耗時短，僅需1 h就能捕獲96個單細胞，并且能夠分辨所捕獲的單細胞是活細胞還是死細胞，同時能將單細胞捕獲及后期的基因組、mRNA、蛋白質等分析完全自動化。

另一種單細胞分離儀基于數字液滴技術[29]。在一次性微流控芯片中，將單細胞和barcodes封裝到近乎納升的液滴中，細胞裂解及逆轉錄等后續(xù)一系列反應將在液滴中進行，反應產物可用于后續(xù)單細胞RNA測序。該單細胞分離儀的優(yōu)勢在于每天能處理成千上萬個細胞，且可直接進行下游分析。

2 單細胞分析

2.1 單細胞DNA分析

20世紀70年代DNA測序技術的出現使得測定生命體的核酸組成成為現實[30-31]?；赑CR法的基因組測序已在20世紀90年代被用于人類單細胞分析[32]，約10年后出現了等溫擴增法[33-34]。單細胞基因組測序技術已被用于分析人類單個生殖細胞的重組模式和非整倍體性[12,35]，以及腫瘤細胞和循環(huán)腫瘤細胞中基因組的異質性[36]。

然而，要進行單細胞基因組測序，就必須以單細胞微量的基因組為模板進行擴增，這成為單細胞分析的另一難點。單細胞全基因組擴增在過去10年中已有實質性進展[37]。單細胞全基因組擴增主要有三大類方法。第一類方法完全基于PCR擴增，采用隨機引物擴增單細胞基因組，如DOP-PCR (Degenerate oligonucleotide-primed polymerase chain reaction)[38]、PEP-PCR (Primer extension preamplif ication PCR)[32]等。這種方法會優(yōu)先擴增基因組中特定的位點，這將導致基因組覆蓋率低，但擴增均勻性更好[27]。第二類方法基于等溫法，最常用的是多重置換擴增 (Multiple displacement amplification, MDA)。采用等溫隨機引物與具有持續(xù)合成能力、高保真性和鏈置換活性的phi29聚合酶延伸基因組[39]，并通過鏈的置換而不斷進行指數擴增。與PCR法相比，等溫法基因組覆蓋率更高，但指數擴增將導致第一擴增位點比例過高[40]。第三類方法將PCR法和等溫法相結合，克服了PCR法覆蓋率低以及等溫法不均勻的缺點。通過限制等溫擴增反應的時間，避免了指數擴增的缺陷，以等溫擴增產物為模板進行PCR擴增獲得全基因組序列[41]。多重退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術 (Multiple annealing and looping based amplification cycles, MALBAC)[42]屬于第三類方法。MALBAC的關鍵在于只復制原始基因組DNA，而不復制擴增產物，擴增產物3′端和5′端通過互補形成環(huán)狀而被保護起來[43]。2017年4月，研究人員開發(fā)出一種新型單細胞基因組擴增法——LIANTI (Linear amplification with transposon insertion)[44]。LIANTI通過插入含有T7啟動子的Tn5轉座子而對單細胞基因組進行線性擴增，能避免指數擴增導致的偏倚和誤差[44]。

目前市場上主要有4款單細胞擴增試劑盒：QIAGEN單細胞擴增試劑盒 (REPLI-g Single Cell Kit)、億康基因MALBAC單細胞DNA快速擴增試劑盒 (MALBAC Single Cell DNA Quick-Amp Kit)、SIGMA 單細胞全基因組擴增試劑盒(GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit) 和Rubicon單細胞擴增試劑盒(PicoPLEX DNA-seq Kit)。這4種單細胞全基因組擴增比較結果如表1所示。

目前單細胞基因組測序技術發(fā)展迅猛，雖然市面上已有許多單細胞基因組擴增試劑盒，但基于目前單細胞基因組擴增的原理，這些試劑盒還存在許多缺陷，如基因組覆蓋率不能達到100%、擴增過程會導致等位基因丟失、單細胞擴增成本昂貴、無法同時對大量單細胞樣本進行擴增等[49]。隨著對單細胞的深入研究，研究者有望開發(fā)出新的單細胞基因組擴增技術，研發(fā)出集單細胞分離、基因組擴增和高通量測序為一體的儀器設備，大大減少單細胞研究的成本和耗時。

表1 4種單細胞全基因組擴增試劑盒比較Table 1 Comparison of 4 single cell whole genome amplification kits

2.2 單細胞RNA分析

單細胞RNA測序是研究細胞發(fā)育過程中轉錄組異質性的一個有效方法[50]，某些新的細胞類型的發(fā)現就得益于單細胞RNA測序，單細胞RNA測序也為了解調控網絡提供了深刻見解[51]。

2017年，10X Genomics公司開發(fā)出一個基于液滴技術的單細胞捕獲系統(tǒng)。該技術的核心是乳液中的凝膠珠 (Gel bead in emulsion，GEM)，凝膠珠由Illumina測序接頭、引物、10× barcodes、分子標簽 (Unique molecular identifiers，UMI) 和oligo-dT組成。凝膠珠在微流體芯片的通道中與單細胞結合，逆轉錄發(fā)生在每一個凝膠珠，帶有條形碼的cDNA大量擴增，構成cDNA庫。其采用的微流控芯片有8個通道，一次可以同時處理8個樣品，每個通道每6 min可以產生約100 000個凝膠珠，加入芯片的細胞約50%能被捕獲[52]。目前，該技術已被用于免疫、腫瘤等方面的研究并取得相關進展，如CD8+T細胞的表觀遺傳學分析[53]、通過研究卡介苗對造血干細胞的作用為疫苗研發(fā)提供了新思路[54]、人腦膠質瘤的單細胞分析為其治療提供了新策略[55]等。

除此之外，Shiroguchi等開發(fā)了一種數字RNA測序技術，通過加入過量的barcodes序列，使幾乎每個cDNA分子兩端都帶上不同的barcodes。PCR后，應用雙末端深度測序可以讀取兩個barcodes和cDNA序列，大大降低了序列依賴性偏倚和擴增噪音[56]。MALBAC除了能用于單細胞全基因組擴增，還可用于單細胞轉錄組擴增，且擴增產物檢測效率高、準確性和可重復性好[57]。

單細胞RNA測序非常適合解決中樞神經系統(tǒng)固有的復雜性和動態(tài)性問題，目前已被應用到大腦分子的分類研究，且有望應用于開發(fā)治療神經退行性疾病的新療法[58]?；诟咄繙y序的單細胞轉錄分析已經應用于數百項研究中，并取得了豐碩的成果，使具有挑戰(zhàn)性的新生物發(fā)現成為可能[59]。

單細胞轉錄組分析方法的最新進展，已經使科學家認識到許多表面上均質的細胞具有令人驚訝的表達差異性。此外，非編碼RNA (Noncoding RNA，ncRNA) 被認為是基因調控過程的關鍵元件，其在單細胞內的表達模式可能有助于剖析單細胞變異的生物學功能。測量單個細胞中的ncRNA對于研究細胞類型和單細胞功能具有重要意義[60]。

2.3 單細胞蛋白質分析

顯然，單細胞基因組和轉錄組只是它的一部分，單細胞的大多數功能是由其蛋白質組決定的。目前蛋白質組分析方法有蛋白質芯片[61]、流式細胞儀分析[62]、免疫共沉淀[63]、質譜分析[64]等，這些方法揭示了樣品中蛋白質的性質。自從單細胞研究興起后，研究人員對單細胞蛋白質也進行了不少研究。早在2009年，激光燒蝕電噴霧電離質譜就被用于單細胞原位代謝組學分析[65]。曾有研究人員采用同位素標記和質譜分析相結合的方法對造血系統(tǒng)的單細胞中34種物質進行分析，有助于盡早發(fā)現細胞病變，研發(fā)出針對性治療藥物[78]?；趩渭毎鞍踪|組學，對腫瘤細胞和正常細胞信號網絡的研究能為癌癥診斷和確定患者預后提供生物標記物[66]。

雖然已有許多研究者對單細胞蛋白、代謝進行了相關研究，但這些研究并不是真正意義上對單顆細胞內蛋白質的研究。無論是質譜、同位素標記、還是流式細胞分析，都只是單細胞層面的蛋白質分析，他們并沒有將單顆細胞內的蛋白質釋放出來，并進行放大用于研究。這是由于單細胞內蛋白質和代謝物含量極低、分離困難，目前還沒有與核酸類似的蛋白質和代謝物的擴增方法[67]，對單細胞蛋白質的研究仍存在許多技術難點。測序技術已廣泛應用于單細胞DNA和RNA分析，但基于測序的單細胞蛋白質組學研究方法尚未見報道[68]。

2.4 單細胞表觀遺傳學

表觀基因組學的研究對象，主要是基因組DNA序列的修飾構象，并將其與表觀遺傳記憶、細胞識別和具有組織特異性的生物學功能聯(lián)系起來[85]。對于差異很小的細胞種群、罕見的細胞類型以及來源于組織的難以區(qū)分的不同細胞混合物，乃至于看似極具有同源性的細胞種群，都會在表觀遺傳、轉錄水平和表型上呈現出極大的差異。單細胞表觀基因組學的研究，有望解決傳統(tǒng)的對群體細胞進行研究的技術缺陷，并為涉及發(fā)育、細胞異質性等重要領域的表觀遺傳學研究開辟新的方向[69]。

單細胞表觀基因組學的研究方法有：單細胞DNA甲基化分析、單細胞染色質映射、單細胞Hi-C、單細胞復制動力學等[69]。

單細胞表觀基因組學的研究方法可以識別染色質的狀態(tài)是開放或是關閉，包括核小體定位，由此可以推斷某些轉錄因子是否結合在個別細胞內特定的DNA序列[70]。隨著單細胞表觀遺傳學的不斷發(fā)展，如今，我們可以在單個細胞分辨率上來研究大多數表觀遺傳調控機制。單細胞表觀基因組學填補了表觀遺傳學發(fā)展過程中，傳統(tǒng)顯微鏡檢查與現代基因組學之間的歷史鴻溝，有望成為表觀遺傳學和基因組調控研究的重要工具[69]。

2.5 循環(huán)腫瘤單細胞分析

循環(huán)腫瘤細胞 (Circulating tumor cell，CTC)源自原發(fā)性腫瘤或者轉移性病變，蘊含有與腫瘤進展和癌癥治療相關分子特征等重要信息[71]，因此對CTC的分析具有重大的臨床意義。

CTC的單細胞分子分析已經產生了一系列意料之外的發(fā)現，例如癌細胞群體的異質性，腫瘤對化學療法產生抗性的原因，以及腫瘤轉移的機制[72]。目前高通量測序技術、微流體技術等技術已被用于CTC單細胞研究。通過研究CTC所揭示的腫瘤細胞異質性，對于理解和預測各種實體瘤治療過程中耐藥性的發(fā)展，以及為癌癥的有效治療制定適當的策略，具有重要的臨床意義[73]。

2.6 單細胞分析研究成果

近年來，研究者對單細胞的不斷深入研究已取得累累碩果。膠質母細胞瘤是一種致命的腦瘤，科學家發(fā)現，雖然靶向mTORC1/C2的CC214-2抑制劑抑制mTOR信號，但癌細胞迅速激活其他信號以促進耐藥性[74]。單細胞磷酸化蛋白質組學繪制了單個腫瘤細胞中的信號網絡，使研究者發(fā)現了癌細胞生長的其他路徑，有助于開發(fā)更有效的膠質母細胞瘤聯(lián)合療法[74]；Navin利用單細胞全基因組測序分析了96例肝癌細胞和15例正常肝細胞，證實了拷貝數變異發(fā)生在肝癌早期，但在肝癌發(fā)展過程中保持相對穩(wěn)定，并發(fā)現znf717基因是肝細胞癌的一個潛在驅動基因，這些發(fā)現揭示了肝細胞癌中多個不同的腫瘤進化機制，為腫瘤治療策略的制定提供了幫助[75-76]。單細胞RNA測序發(fā)現了新型免疫細胞，為研究免疫反應提供了另一種途徑。根據RNA測序數據，科學家開發(fā)了一種新的算法來重建配對的T細胞受體 (TCR) 序列，并將T細胞特異性與功能性反應相關聯(lián)[77]；通過對648個單細胞進行單細胞RNA測序的分析，應用t-SNE細胞分型、SCDE基因差異表達分析，科學家們發(fā)現了新的免疫細胞CD62L+ILC3[78]。最近的進展，如大規(guī)模并行單細胞RNA-Seq和復雜的計算方法，正在催化我們對免疫學理解的一場革命。近年來大規(guī)模的單細胞RNA測序使研究者對免疫學有了更加深刻的理解，例如單細胞技術有望用于解讀免疫系統(tǒng)的適應性和固有成分[79]。單細胞RNA測序被用于分類成年小鼠視皮層的皮質細胞，確定了49種細胞轉錄組類型，包括23種GABAergic、19種glutamatergic和7種非神經型，揭示細胞類型的多樣性[80]?；贛ALBAC技術開發(fā)的產前診斷新方法，以及在它的基礎上開發(fā)的胚胎植入前基因組篩查技術——MARSALA (Mutated allele revealed by sequencing with aneuploidy and linkage analyses)，可以同時檢測單基因疾病和非整倍體，并且能夠以經濟有效的方式進行連鎖分析，這可使父母免于將他們的遺傳病傳遞給后代[81-82]。

2.7 單細胞研究優(yōu)勢和局限

單細胞研究的主要優(yōu)勢體現在疾病分析方面，多細胞分析可能會掩蓋了群體中細胞特征的真實變異。以單細胞作為疾病分析的生物學單位，可以更準確地記錄細胞反應的個體和范圍，其價值逐漸得到認可。單細胞研究可以鑒定腫瘤內罕見的基因突變，更好地了解信號傳導和代謝途徑，制定最佳治療方案以防止腫瘤再生[83]。

單細胞科學試圖測量跨細胞群體的生物異質性，以提供對整體生物學狀態(tài)或疾病狀態(tài)的定量描述。例如單細胞轉錄組學可以提供關于細胞之間的生物變異信息[83]。在單細胞研究的數據分析方面，雖然許多方法已成功用于分析大量樣本的基因組數據，但對于相對較短的測序讀長，數據的稀疏結構以及細胞群異質性對有效的數據分析提出了重大的挑戰(zhàn)[84]。

3 本實驗室工作內容和經驗

在“國家自然科學基金”等項目的資助下，本團隊對單細胞操作和分析已有一定研究基礎，并在實踐解決問題的過程中積累了一定經驗。

本團隊近期的主要研究課題之一是CRISPR基因編輯技術。眾所周知，在CRISPR編輯基因組時有可能發(fā)生脫靶效應，同時在編輯之后，靶細胞會啟動DNA的損傷修復機制，在修復的過程中可能會導致一些意料之外的堿基的插入或缺失，這一現象具有潛在的副作用，比如可能會引發(fā)腫瘤相關基因的過表達或抑制，進而限制了CRISPR技術的臨床應用安全性。而此前在CRISPR基因編輯副作用方面的研究，主要以細胞群體 (多細胞) 為主[85-87]，本實驗室嘗試將CRISPR基因編輯技術與單細胞研究相結合，在單細胞水平上檢驗CRISPR基因編輯技術對細胞的影響，爭取打破多細胞研究的局限。

例如，在單細胞挑取方面，本課題組結合各種單細胞分離方法的優(yōu)缺點，為了達到最好的精確度，采用的單細胞分離方法為人工顯微移液法。經過不斷的實驗以及條件優(yōu)化，我們總結出用1 mL培養(yǎng)基重懸約500個單細胞，并均勻鋪于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，此時的細胞密度在顯微鏡下挑取單細胞較為適合，容易在顯微鏡下找到單個細胞，并且不易吸到多個細胞。

本團隊在單細胞基因組擴增方面，曾嘗試使用基于phi29 DNA 聚合酶的多種單細胞DNA擴增技術和基于PCR的單細胞擴增技術，使用phi29技術時，本團隊已經能夠從單個細胞中擴增獲得長度大于21 kb的單細胞基因組，對擴增所得基因組進行高通量測序并進行數據分析后發(fā)現，基于phi29 DNA聚合酶的單細胞擴增試劑盒擴增單細胞基因組所產生的偏倚和誤差非常嚴重，基因組的部分區(qū)域大量擴增，而某些區(qū)域則幾乎沒有擴增，在SNP分析中，也許可以通過擴大測序數據量來解決問題，而在CNVs等分析中就顯得無能為力，但是phi29方法的最大好處在于能夠得到大于21 kb的基因組序列，非常適于分析SV?；赑CR技術的單細胞擴增，可以解決上述擴增覆蓋率不均勻的問題，但是缺點在于擴增片段長度很短。此外，本團隊還將開展CRISPR編輯后的單細胞RNA轉錄組和蛋白質組分析。相關研究對于驗證CRISPR基因編輯技術的副作用有重要意義。

4 展望

單細胞的分離技術，從最初的顯微移液法到激光捕獲顯微切割，一直到近年來最先進的微流體技術，朝著自動化和高通量以及高精度的方向發(fā)展，這一切都離不開材料科學、納米科學、自動化技術的進步。但是，現有的單細胞分離技術，基本上都局限在體外培養(yǎng)的細胞系，隨著科學研究的深入，能否開發(fā)出直接從活體組織，尤其是實體組織里分離單細胞的技術？畢竟，體內狀態(tài)下的細胞和體外的細胞有著非常大的區(qū)別，只有對體內的細胞進行研究，才是反映最真實的自然狀態(tài)，才能幫助我們理解最真實的生命過程。另外，體內條件下獲得的單細胞，常常在生物醫(yī)學上有重要用途，比如用于腫瘤標記物的研究、腫瘤干細胞研究、免疫治療研究、再生醫(yī)學研究等等。但是，這就有很多工程技術上的問題需要克服，首先是活體、尤其是實體組織如何取材？如何把組織分散為單個的細胞？當然，血液等流體會相對容易。其次，活體的細胞，無論在細胞形狀、大小、細胞活性、狀態(tài)，都與體外的細胞系有很大的區(qū)別，活體細胞常常是高度分化的，一塊組織中可能有多種不同類型的細胞，把細胞分類就是一個很大的難題，此外不同細胞內各種物質的含量常常具有重大差異，即便分離出活體單細胞，后續(xù)分析能否勝任極度微量的物質的分析？另外，有些細胞種群是非常稀有罕見的，如何在活體里提取、分揀和富集這些稀有的細胞，難度也非常大。此外，活體的某些類型單細胞，在組織解離分散、流體分揀挑選等過程，在各種不同的物理和化學環(huán)境中能否保持存活狀態(tài)？隨著高精度手術機器人、納米機器、磁珠分離、人工智能和機器學習等技術的興起，也許單細胞的分離技術能夠更加先進、更加智能，例如可以根據研究目的和需求，可以更加有選擇性、目的性和高精度，比如優(yōu)選地挑取有特殊形狀、特殊狀態(tài)、特殊顏色的細胞，或者根據所檢測到的細胞狀態(tài)和類型，將細胞分配到不同的物理和化學條件下進行分揀，比如自動選擇不同的pH和不同滲透壓的緩沖液，以及選擇不同流體剪切力和不同孔徑大小的流體腔室，以保證單細胞分離的成功，減少人工的干預和誤判，這應是將來的發(fā)展方向之一。

在單細胞內物質分析層面，本文從DNA、RNA、蛋白質逐一進行了介紹。隨著新一代測序技術的崛起，目前對于單細胞DNA和RNA的分析已經趨于成熟。但是仍有可以發(fā)展的空間。例如，現有的單細胞DNA分析，所涉及到的單細胞DNA擴增技術，難免會造成擴增后的產物和原始的DNA存在偏倚，因此，目前也有很多科學家在開發(fā)具有高保真、能忠實還原原始DNA信息的單細胞DNA擴增技術，目前最先進的高通量單細胞分離 (微流體技術)，還只能用于RNA分析，而對單細胞DNA分析不兼容。這就限制了單細胞DNA分析的通量和成本。在單細胞RNA分析領域，缺少能對單細胞總RNA直接進行大量擴增的技術，因此，對于一些微量或半衰期極短的RNA分子，現有的分析技術的靈敏度可能無法企及，而且RNA的種類眾多，例如長的非編碼RNA、mRNA、環(huán)狀RNA、miRNA、piRNA、rRNA、tRNA等等，現有的單細胞RNA分析技術，絕無能力把不同類型的RNA進行純化和分類，而不同類型的RNA，其分析和測序方法也不同，因此，在單細胞RNA分析層面，還有很多技術需要深入發(fā)展，事實上，現有的單細胞RNA測序，也僅僅只能分析mRNA等少數幾種類型的RNA。另外，現有的單細胞DNA和RNA分析技術，很大程度上依賴于Illumina的測序技術，但是它的讀長一般都只有幾百個bp，比較短。在DNA層面，若要發(fā)現SV和CNV和融合基因；在RNA層面，若要發(fā)現可變剪接，較長讀長的測序技術顯然更有優(yōu)勢，但是，目前尚未見成熟的、能和較長讀長測序技術兼容的單細胞DNA和RNA分析技術。在蛋白質分析方面，現有的研究報道少之又少，單細胞層面的蛋白質質譜、蛋白質測序，甚至蛋白質結構分析、單細胞蛋白質組學分析，對工程技術的要求比其他任何生物分析都高，蛋白是生命的基礎，其種類和數量眾多，但在目前的技術背景下，對單細胞蛋白進行定性和定量分析，仍是無法逾越的。

此外，在單細胞內還存在各種糖類、脂類物質，它們對細胞的各種生物學行為也有重大調控作用，另外，不同的單細胞相互之間存在通訊交流的現象，這也是單細胞研究需要關注的內容。另外，近年來單分子的研究發(fā)展也非常迅速，比如單分子熒光[88]、單分子成像[89]等，將單分子技術結合單細胞研究技術也是未來的發(fā)展方向之一。實時成像可以對動態(tài)的細胞生命過程進行可視化和分析，例如單細胞成像有助于研究胚胎發(fā)育過程中調節(jié)細胞命運和形態(tài)發(fā)生的過程，神經元回路和非神經元細胞類型對神經功能的貢獻，基于成像的新方法還能以高時空分辨率解析神經疾病和癌癥[90]。除此之外，單細胞研究在原位轉錄組分析、實時成像轉錄組分析、譜系示蹤技術、單細胞多組學、細胞狀態(tài)分布建模與預測、細胞功能驗證、疾病研究、跨學科研究等方面[73]，具有較好的發(fā)展前景和空間。

5 結語

DNA、RNA、蛋白質是構成細胞的基礎物質，細胞又是構成生命的基本單元。細胞存在分化和異質性，細胞和細胞之間的差異造成了不同的生命功能和生物學現象。只有深入研究單細胞，把傳統(tǒng)的在組織學、多細胞層面的研究深入到單細胞層面，才能更好地了解生命，揭示分子機制。無論在生命科學基礎理論研究，還是在生物醫(yī)學應用研究，或是生物工程學研究，單細胞研究必定是未來的重點研究方向之一。

隨著單細胞分析技術的不斷發(fā)展和成熟，單細胞分析也將在各種疾病中得到廣泛應用。在腫瘤治療方面，單細胞全基因組測序對尋找突變位點、研究腫瘤的進化機制意義重大。而對單細胞蛋白質的分析，能夠研究正常和病變細胞的信號通路，揭示癌癥的發(fā)生發(fā)展機制，為腫瘤的治療提供全新的思路。在免疫系統(tǒng)研究方面，單細胞研究有助于發(fā)現新的免疫細胞，通過對免疫細胞信號通路的研究，能為疫苗的研制與開發(fā)提供深刻見解。在生殖健康方面，單細胞全基因組測序能夠檢測出堿基片段缺失或增添，有助于避免遺傳疾病。雖然，單細胞分析技術有著眾多優(yōu)勢，但其發(fā)展和成熟之路卻將漫長而艱難。