劉 舒，宋鳳瑞，皮子鳳，劉志強(qiáng)

（中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林省中藥化學(xué)與質(zhì)譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 長(zhǎng)春 130022）

1 引言

中醫(yī)藥治療疾病具有整體協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì)和特色，在慢性疾病、代謝綜合性疾病等病理機(jī)制復(fù)雜的疾病治療中顯示出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。然而，由于“中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚、作用機(jī)制不明晰”等問(wèn)題的存在，致使中藥長(zhǎng)期以來(lái)受到眾多質(zhì)疑。其中，中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚是制約人們科學(xué)認(rèn)識(shí)中藥的核心問(wèn)題。

然而，中藥成分十分復(fù)雜，即使是單味藥，仍可能含有成千上萬(wàn)種化學(xué)成分，并且，傳統(tǒng)中藥以口服用藥為主，首過(guò)效應(yīng)的存在致使其進(jìn)入體內(nèi)的原型成分和代謝產(chǎn)物濃度均較低，加之內(nèi)源性基質(zhì)干擾嚴(yán)重，致使中藥體內(nèi)微量和痕量未知新成分的快速精準(zhǔn)辨識(shí)十分困難，而這些成分往往是發(fā)揮藥效的關(guān)鍵成分；此外，進(jìn)入體內(nèi)的中藥原型成分和代謝成分，并不一定都是效應(yīng)成分，需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的活性篩選和評(píng)價(jià)才能最終闡明中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)，目前常用的活性篩選方法是基于分離得到單體成分的前提下進(jìn)行的，不僅微量痕量成分的分離制備十分困難，而且分離得到的單體成分很多為非效應(yīng)成分，耗時(shí)費(fèi)力，致使中藥體內(nèi)藥效成分的快速篩選成為中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)研究的另一巨大挑戰(zhàn)。鑒于此，急需突破中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)的高效發(fā)現(xiàn)技術(shù)，構(gòu)建中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)的快速發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)辨識(shí)方法，解決制約中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的關(guān)鍵科學(xué)難題。

2 基于“體外-體內(nèi)”多維化學(xué)物質(zhì)組逐層遞進(jìn)關(guān)聯(lián)分析策略的中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路

圖1 “體外-體內(nèi)”多維化學(xué)物質(zhì)組逐層遞進(jìn)關(guān)聯(lián)分析的“四步法”研究思路

眾所周知，傳統(tǒng)中藥以口服用藥為主，其化學(xué)成分必然會(huì)受胃腸道酸堿性、腸道微生物及代謝酶等影響發(fā)生轉(zhuǎn)化，且吸收進(jìn)入體內(nèi)后，會(huì)在肝臟作用下發(fā)生進(jìn)一步的代謝反應(yīng)，使體內(nèi)藥源性成分除原型成分外，還可能存在大量代謝產(chǎn)物。針對(duì)口服中藥這一特點(diǎn)，作者團(tuán)隊(duì)提出了基于“體外-體內(nèi)”多維化學(xué)物質(zhì)組逐層遞進(jìn)關(guān)聯(lián)分析策略的中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路，增強(qiáng)了分析靶向性，實(shí)現(xiàn)中藥體內(nèi)藥效成分的快速發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)辨識(shí)。

具體闡述如下：①建立基于質(zhì)譜特征診斷離子的中藥復(fù)雜體系化學(xué)成分結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)表征方法，闡明中藥體外原型化學(xué)物質(zhì)組；并以此為基礎(chǔ)，建立包含質(zhì)譜特征診斷離子、分子量和色譜保留時(shí)間等信息的本地化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)；②建立藥物體外腸內(nèi)菌代謝和肝微粒體代謝研究模型，研究中藥的體外腸內(nèi)菌代謝物質(zhì)組和肝微粒代謝物質(zhì)組，闡明各類(lèi)成分（如皂苷、三萜、寡糖酯等）的代謝規(guī)律，并將體外代謝物質(zhì)組及其特征代謝規(guī)律加入到本地化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，使數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)一步擴(kuò)充；③基于已構(gòu)建的本地化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，靶向分析在體糞便和肝臟中的藥源性成分，并將相關(guān)代謝產(chǎn)物信息加入到本地化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)信息得到最終完善；以此為指導(dǎo)，靶向篩選血液和靶器官中的藥源性成分，闡明體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組；④以體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組研究結(jié)果為指導(dǎo)，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析（即靶向網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析），闡明作用于疾病靶點(diǎn)和通路的化學(xué)成分，并對(duì)預(yù)測(cè)的關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證，最終明確中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制。并且，對(duì)于中藥復(fù)方體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，可以基于上述研究策略，進(jìn)行“特征單體成分—單味藥材成分—中藥復(fù)方成分”的逐層遞進(jìn)分析，從而實(shí)現(xiàn)中藥復(fù)方體內(nèi)藥效成分的精準(zhǔn)辨識(shí)。

該研究策略充分考慮了中藥成分復(fù)雜、理化性質(zhì)及含量差異懸殊、同分異構(gòu)體多、代謝產(chǎn)物動(dòng)態(tài)變化且未知成分多、標(biāo)準(zhǔn)品缺乏等特點(diǎn)，通過(guò)逐層遞進(jìn)分析分解解析難度，由易到難，循序漸進(jìn)，有目的性和導(dǎo)向性的解析體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組和體內(nèi)藥效物質(zhì)組，可以極大地提高復(fù)雜基質(zhì)樣品中體內(nèi)化學(xué)物質(zhì)組和體內(nèi)藥效物質(zhì)組的發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)確度和效率，解決微量、未知、結(jié)構(gòu)類(lèi)似、動(dòng)態(tài)變化的體內(nèi)藥效成分快速發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)辨識(shí)難題（圖1）。

3 中藥復(fù)雜體系成分鑒定方法的建立及應(yīng)用

中藥具有成分復(fù)雜、同分異構(gòu)體多、未知成分繁多、標(biāo)準(zhǔn)品缺乏等特點(diǎn)，致使中藥成分的分析鑒定十分困難。為此，在體外原型化學(xué)物質(zhì)組研究方面，作者研究團(tuán)隊(duì)將色譜分離、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析和質(zhì)譜技術(shù)創(chuàng)新性融合，構(gòu)建了中藥復(fù)雜體系化學(xué)成分分析方法。例如，針對(duì)中藥梔子體外化學(xué)物質(zhì)組鑒定難題，作者研究團(tuán)隊(duì)建立了多級(jí)分離結(jié)合特征診斷離子匹配的微量成分和同分異構(gòu)體成分精準(zhǔn)辨識(shí)方法，成功鑒定出了包括環(huán)烯醚萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、單萜類(lèi)、二萜類(lèi)及多酚類(lèi)等在內(nèi)的71種化學(xué)成分，并且利用離子淌度三級(jí)分離技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了梔子中4種新的西紅花苷-3和西紅花苷-4同分異構(gòu)體[1]（圖2）。建立基于質(zhì)譜診斷離子的“特征單體成分—單味藥材成分—中藥復(fù)方成分”逐層遞進(jìn)分析方法，對(duì)烏頭湯、復(fù)方夏連膠囊等進(jìn)行了研究，獲得了其體外化學(xué)物質(zhì)組[2,3]。在體外代謝物質(zhì)組研究方面，利用體外腸內(nèi)菌代謝和體外肝微粒體代謝模型，實(shí)現(xiàn)了藥物體外代謝物質(zhì)組的分析和表征。例如，馮等研究表明，人參皂苷類(lèi)成分在腸道菌群作用下主要產(chǎn)生去糖基化產(chǎn)物，生成更易吸收的弱極性成分。腸內(nèi)菌代謝的主要產(chǎn)物在肝微粒體作用下，主要產(chǎn)生羥基化等氧化還原反應(yīng)產(chǎn)物，初步闡明了人參皂苷I相代謝的循序漸進(jìn)及系統(tǒng)性，可為后續(xù)的人參皂苷類(lèi)成分的體內(nèi)代謝研究提供重要參考[4]。在體內(nèi)藥效成分研究方面，作者團(tuán)隊(duì)建立了以入血成分為導(dǎo)向的靶向網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，明確了烏頭湯治療佐劑型關(guān)節(jié)炎的主要活性成分為烏頭類(lèi)生物堿、麻黃堿，以及甘草苷、芒柄花素、芍藥苷等成分[5]。復(fù)方夏連膠囊治療慢性萎縮性胃炎的主要活性成分為小檗堿、甘草酸、漢黃芩素及人參皂苷等9種成分[6]。

圖2 多級(jí)分離結(jié)合特征診斷離子匹配的梔子中微量成分和同分異構(gòu)體成分分析

4 基于“體外-體內(nèi)”多維化學(xué)物質(zhì)組逐層遞進(jìn)關(guān)聯(lián)分析策略的茯苓治療阿爾茲海默癥的體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

茯苓三萜酸類(lèi)成分是茯苓中的主要活性成分之一，但其含量低、結(jié)構(gòu)相似、同分異構(gòu)體多、電離效率低，尤其是缺乏足夠的對(duì)照品，嚴(yán)重阻礙了茯苓三萜酸類(lèi)成分的定性分析?；诖耍紫?，我們提出了一種超高效液相色譜-多維質(zhì)譜法結(jié)合UNIFI軟件數(shù)據(jù)后處理技術(shù)的靶向數(shù)據(jù)分析策略，用于茯苓三萜酸類(lèi)成分的快速定性分析，從茯苓中共鑒定出121種茯苓三萜酸類(lèi)成分，以此作為茯苓三萜酸類(lèi)成分的本地化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)[7]。其次，選取特征性茯苓三萜酸類(lèi)成分單體作為研究對(duì)象，利用體外大鼠腸內(nèi)菌代謝和大鼠肝微粒體代謝模型，研究了茯苓三萜類(lèi)成分的腸內(nèi)菌及肝微粒代謝規(guī)律，發(fā)現(xiàn)茯苓三萜類(lèi)成分在腸內(nèi)菌作用下基本不發(fā)生代謝反應(yīng)，而是直接通過(guò)小腸上皮細(xì)胞吸收進(jìn)入體內(nèi)；而茯苓三萜酸類(lèi)成分在肝微粒體作用下主要發(fā)生氧化反應(yīng)，包括單加氧和雙加氧的代謝反應(yīng)，以此規(guī)律為指導(dǎo)，推測(cè)其它茯苓三萜酸類(lèi)成分在體內(nèi)可能產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，將其信息加入到本地化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。以此數(shù)據(jù)庫(kù)為依托，對(duì)吸收進(jìn)入體內(nèi)的茯苓三萜酸類(lèi)成分進(jìn)行篩選和鑒定，共鑒定出62種原型成分和59種代謝物。最后，以入血成分為指導(dǎo)，通過(guò)靶向網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，篩選出治療阿爾茨海默病的有效吸收成分，初步闡明了茯苓治療阿爾茲海默癥的體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。

5 總結(jié)與展望

中醫(yī)藥作為具有豐富科學(xué)內(nèi)涵的復(fù)雜體系，在多成分多靶點(diǎn)協(xié)同整合治療疾病方面體現(xiàn)出了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，然而，也由于其體系的復(fù)雜性，給其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究帶來(lái)的極大的挑戰(zhàn)，致使多數(shù)中藥治療疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不十分清楚，大大限制了人們對(duì)中藥治療疾病的科學(xué)認(rèn)識(shí)。因此，中醫(yī)藥的傳承和發(fā)展，必須借助不斷發(fā)展的現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)建立適合中醫(yī)藥復(fù)雜體系的創(chuàng)新方法，來(lái)深入研究中藥的物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)，并在此基礎(chǔ)上明確其有效成分、闡明其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，才能使其在世界范圍被認(rèn)可、接受，才能從根本上保證中藥質(zhì)量的穩(wěn)定可控，促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。近年來(lái)，中藥學(xué)者對(duì)于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究日益重視，新的研究思路、研究方法和先進(jìn)技術(shù)手段被應(yīng)用于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中，取得了重大突破。未來(lái)，隨著分析檢測(cè)技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)等的發(fā)展，將會(huì)產(chǎn)生更多的新思路、新方法，用于解決中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中存在的技術(shù)瓶頸問(wèn)題，從而促進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展。