何新 胡曉梅 黃文峰 李元成 范琳 張自翔 孟凡

1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（江西贛州341000）；2贛南醫(yī)學(xué)院（江西贛州 341000）

結(jié)直腸癌是危害人類健康的最常見的惡性腫瘤之一，大約20%的新診斷的結(jié)直腸癌已經(jīng)并發(fā)轉(zhuǎn)移性，嚴(yán)重的影響了患者的治療及預(yù)后［1-2］。因此，尋找新的診療靶點(diǎn)及策略顯得尤為重要［2］。研究［3］表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與信號(hào)通路失調(diào)有關(guān)，其中Ras信號(hào)傳導(dǎo)是最常發(fā)生失調(diào)的一種。因此，靶向Ras信號(hào)有望成為治療結(jié)直腸癌的治療手段［3］。Ras是一系列膜結(jié)合的小GTP酶，包括NRAS，HRAS和KRAS［4］。Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子（RasGEFs）和GTP酶活化蛋白（GAPs）負(fù)責(zé)在活性GTP結(jié)合Ras（Ras?GTP）和非活動(dòng)GDP結(jié)合Ras（Ras?GDP）之間轉(zhuǎn)換［5］。 Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子 1（RasGRF1）是促進(jìn) Ras?GTP 活化的RasGEF家族成員［6］。最近有研究［7］證實(shí)在星形細(xì)胞瘤中RasGRF1高表達(dá)，RasGRF1的沉默導(dǎo)致癌細(xì)胞中miR?137表達(dá)上調(diào)，顯著抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲并增強(qiáng)體外細(xì)胞凋亡。然而，目前Ras?GRF1在人結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)模式和作用大部分仍然未知，國內(nèi)尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。KRAS基因突變及RAS信號(hào)通路活化是結(jié)直腸癌靶向治療耐藥的主要機(jī)制，所以針對(duì)RAS基因突變及導(dǎo)致RAS信號(hào)通路的異?；罨膯栴}，是當(dāng)今結(jié)直腸癌靶向治療中的難題［8］。本研究選擇RasGRF1作為潛在的治療靶標(biāo)，探討RasGRF1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。結(jié)果將為結(jié)腸癌的靶向治療挖掘到有價(jià)值的研究靶分子，也為其它RAS突變相關(guān)的腫瘤研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116、SW116和SW480細(xì)胞（購于ATCC）；Varioskan Flash連續(xù)光譜多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；T1?96型PCR儀（德國BIOMETRA公司）；FACS calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶（美國HyClone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；lipofectamine 2000（美國Thermo Fisher Scientific公司）；siRasGRF1及Control siRNA（美國Sigma公司）；MTT、DMSO（Sigma公司）；Annexin V?FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HCT116、SW116和SW480細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 siRNA表達(dá)載體的制備及轉(zhuǎn)染使用在線工具 http：//i.cs.hku.hk/～sirna 設(shè)計(jì) RasGRF1 的 siRNA序列（siRasGRF1；有義：5′?CUAAAGCUUUGAUUG?AUAAdTdT?3′；反義：5′?UUAUCAAUCAAAGCU?UU?AGdTdT?3′）。為了優(yōu)化RasGRF1敲低的效率，使用lipofectamine 2000將不同濃度的siRNA（25，50，100和200 nmol/L）轉(zhuǎn)染到HCT116細(xì)胞中。未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別用作空白和陰性對(duì)照（NC）。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT?PCR）檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116，SW116和SW480中RasGRF1的mRNA表達(dá)。分別收集HCT116，SW116和SW480的細(xì)胞，提取總RNA（按試劑盒說明操作），電泳鑒定總RNA提取效果，定量后進(jìn)行RT?PCR。RasGRF1引物序列：正義引物為5′?CGCTGCCTCC?ACAACTACAA?3′，反義引物為 5′?ACACAGGGTG?GGTCACAATTT ?3′。β?actin序列：正義引物為5′?CATGGGTCAGAAGGATTCCT?3′，反義引物為 5′?TCGTCCCAGTTGGTGACGAT?3′。共同 PCR 條件為：94℃變性40 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 四氮噻唑藍(lán)（MTT）比色法分析細(xì)胞增殖采用MTT法測定分別干擾RasGRF1前后24、48、72 h的各組細(xì)胞存活率。取3塊96孔板，以4×104/mL的密度接種HCT116細(xì)胞懸液180 μL/孔，實(shí)驗(yàn)設(shè)siRNA組、陰性對(duì)照組（NC組）、及空白對(duì)照組（HCT116組），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，取出相應(yīng)96孔板，每孔分別加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄各孔液體，每孔加入DMSO 150 μL，置于搖床上震蕩10 min，用酶聯(lián)免疫吸附法測定490 nm處吸光度（A）值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡和細(xì)胞周期改變?nèi)?塊6孔板，分兩組，分別進(jìn)行凋亡和細(xì)胞周期檢測。以4×104/mL的密度接種HCT116細(xì)胞懸液180 μL/孔，實(shí)驗(yàn)設(shè)siRNA組、陰性對(duì)照組（NC組）、及空白對(duì)照組（HCT116組）。轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2遍，1 000 r/min離心5 min，棄上清，緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃過夜。離心棄乙醇，PBS洗滌2遍，加入RNA酶，37℃水浴 30 min ，一組加入5 μL Annexin V?FITC混勻后，再加入5 μL PI混勻后4℃避光染色30 min，流式術(shù)分析各組的早期凋亡和晚期凋亡情況。另一組僅加入5 μL PI混勻后4℃避光染色30 min，流式術(shù)分析細(xì)胞周期的變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RasGRF1在人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中過表達(dá)本研究檢測了3株結(jié)直腸癌細(xì)胞系（HCT116，SW116和SW480）中RasGRF1的mRNA表達(dá)。在這3株細(xì)胞系中，HCT116細(xì)胞的RasGRF1的mRNA水平，與其他兩種細(xì)胞相比明顯升高（P＜0.05，圖1）。因此，選擇HCT116進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

圖1 結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116，SW116和SW480中RasGRF1的表達(dá)Fig.1 Expression of RasGRF1 in colorectal cancer cell line HCT116，SW116 and SW480

2.2 RasGRF1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖的影響本研究還檢查了HCT116中siRNA介導(dǎo)的RasGRF1敲低的效率。如圖2所示，在HCT116中，針對(duì)RasGRF1的siRNA的抑制率可達(dá)85.71%，表明RasGRF1在HCT116中的有效抑制。RasGRF1在HCT116細(xì)胞增殖中的作用見圖3、表1。將RasGRF1siRNA及NCsiRNA分別導(dǎo)入HCT116細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與NC組及正常細(xì)胞組相比，發(fā)現(xiàn)siRas?GRF1轉(zhuǎn)染的HCT116細(xì)胞的增殖率顯著降低（P＜0.01）。

圖2 qRT?PCR檢測各種濃度的NC siRNA和siRasGRF1轉(zhuǎn)染HCT116的RasGRF1的表達(dá)Fig.2 qRT?PCR detection of various concentrationsof NC siRNA and siRasGRF1 transfection of HCT116 for RasGRF1 expression

2.3 RasGRF1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116凋亡和細(xì)胞周期的影響為了研究siRNA干擾RasGRF1表達(dá)對(duì)HCT116增殖的抑制作用是否與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期相關(guān)，本研究行流式細(xì)胞術(shù)測定了Ras?GRF1對(duì)早期凋亡和晚期凋亡的影響及細(xì)胞周期的分布。與對(duì)照組相比，siRasGRF1轉(zhuǎn)染組的早期和晚期凋亡率顯著增加（P＜0.05，圖4），表明由于siRNA干擾RasGRF1表達(dá)引起的細(xì)胞增殖率的顯著降低可能與其細(xì)胞早期和晚期凋亡率顯著增加有關(guān)。本研究還使用流式細(xì)胞術(shù)測定了siRNA干擾RasGRF1表達(dá)引起的細(xì)胞周期的分布變化。與對(duì)照組相比，siRNA干擾RasGRF1表達(dá)導(dǎo)致G1期（凋亡群體）細(xì)胞增加13%以上，S期細(xì)胞也明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見圖5）。這表明siRNA干擾RasGRF1表達(dá)引起的的細(xì)胞增殖降低可能也于細(xì)胞周期停滯在G1期相關(guān)。

圖3 MTT法檢測RasGRF1siRNA干擾對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響（#P＜0.01）Fig.3 Effect of RasGRF1siRNA transduction on proliferation of HCT116 cells by MTT assay（#P ＜ 0.01）

表1 RasGRF1siRNA干擾對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effect of RasGRF1siRNA transduction on proliferation of HCT116 cell ±s

表1 RasGRF1siRNA干擾對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effect of RasGRF1siRNA transduction on proliferation of HCT116 cell ±s

注：*P＜0.01

生長增殖率HCT116 NCsiRNA siRasGRF1 72 h 327.23±1.1*32523±6.2*273.73±4.9 0 h 100 100 100 24 h 125.01±49 129.31±3.4 120.07±71 48 h 206.23±1.1*199.52±7.2 188.15±5.6

圖4 siRNA干擾RasGRF1表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of siRNA interference with RasGRF1 expression on apoptosis of HCT116 cells

圖5 siRNA干擾RasGRF1表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞周期分布的影響Fig.5 Effect of siRNA interference with RasGRF1 expression on cell cycle distribution of HCT116

3 討論

隨著近年來人們生活模式及飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率每年仍呈上升趨勢。研究認(rèn)為，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與某些基因的異常表達(dá)調(diào)控及信號(hào)通路的異常密切相關(guān)［8］。既往研究表明：作為RasGEF超家族成員，RasGRF1在包括人橫紋肌肉瘤，皮膚癌和膀胱癌在內(nèi)的一些人類癌癥中表達(dá)上調(diào)，RasGRF1的過表達(dá)不僅促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲，而且保護(hù)癌細(xì)胞抵抗凋亡［9-10］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)胰島素樣生長因子2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RasGRF1表達(dá)的降低可抑制平滑肌肉瘤細(xì)胞的遷移。另有研究［10］表明，RasGRF1衍生的多肽可競爭性抑制RasGRF1，導(dǎo)致Ras?GTP的細(xì)胞水平降低，并抑制人膀胱癌的細(xì)胞增殖和遷移。最近，有研究［11］報(bào)道了在結(jié)直腸患者的腫瘤和血漿樣本中測量的KRAS突變的一致性，切除后檢測血漿中的體細(xì)胞突變與CRC中的疾病復(fù)發(fā)密切相關(guān)。類似地，在非小細(xì)胞肺癌中，血漿中KRAS突變的檢測與對(duì)治療的反應(yīng)缺乏相關(guān)［12］。因此，靶向RasGRF1可能成為惡性腫瘤治療的潛在手段。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)RasGRF1在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中過度表達(dá)，這提示RasGRF1可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。因此，HCT116細(xì)胞系是用于研究結(jié)直腸癌中RasGRF1功能的良好細(xì)胞模型。正如預(yù)期的那樣，本研究結(jié)果顯示siRNA干擾RasGRF1表達(dá)抑制HCT116的細(xì)胞增殖。本研究使用流式術(shù)測定了siRNA干擾RasGRF1表達(dá)引起的早期凋亡、晚期凋亡和細(xì)胞周期的分布變化，發(fā)現(xiàn)siRasGRF1轉(zhuǎn)染組的HCT116的早期和晚期凋亡率顯著增加，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期。本研究的不足之處為尚缺乏臨床標(biāo)本數(shù)據(jù)支持，有待臨床收集結(jié)腸癌及癌旁標(biāo)本及進(jìn)行前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證所得結(jié)論。先前的研究［13］表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與Ras信號(hào)通路密切相關(guān)。下一步實(shí)驗(yàn)，計(jì)劃繼續(xù)研究siRNA干擾RasGRF1表達(dá)對(duì)Ras通路下游分子（包括p?AKT，p?PI3K和p?ERK）活化的影響，進(jìn)一步探討siRNA干擾RasGRF1表達(dá)可能是通過哪些信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖和凋亡。

本研究首次研究報(bào)告了RasGRF1表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖和凋亡的影響，結(jié)果表明：RasGRF1在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖和凋亡過程中起到了重要作用，RasGRF1可能作為一種促癌因子參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程。雖然多種腫瘤中均證實(shí)了RasGRF1對(duì)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的影響，本研究也在結(jié)腸癌中針對(duì)腫瘤增殖和凋亡開展了一系列相關(guān)研究并取得了一定的陽性結(jié)果，但目前RasGRF1作為結(jié)腸癌治療的靶點(diǎn)仍未被發(fā)現(xiàn)，也缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。后續(xù)工作中，筆者將綜合臨床標(biāo)本及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，篩選RasGRF1相關(guān)的作用靶點(diǎn)，明確RasGRF1在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的確切分子機(jī)制，為其將來的臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)。綜上所述，本研究探索了RasGRF1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增值、凋亡及細(xì)胞周期的影響，進(jìn)一步研究有望作為結(jié)腸癌患者獨(dú)立的分子標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。