祝 賀，敖俊紅，楊蓉婭

毛孢子菌廣泛存在于部隊日常野外訓(xùn)練接觸到的土壤、水源及腐敗植物中，實際感染率并不低。傳統(tǒng)的診斷方法主要是皮損、血漿、痰、腦脊液或內(nèi)臟組織培養(yǎng)。其中，血培養(yǎng)對侵襲性真菌感染的診斷尤為常用，但檢出率較低，漏診幾率較高。毛孢子菌感染的篩查在臨床中特別是在重癥監(jiān)護病房（ICU）、導(dǎo)管室等感染高發(fā)部門還沒有普遍開展。

(1,3)-β-D-葡聚糖（BG）是真菌細(xì)胞壁主要組成成分，只有當(dāng)真菌被吞噬、細(xì)胞壁被破壞后才釋放到血液和其他體液中。臨床上檢測BG的實驗稱為G試驗，主要用于診斷侵襲性念珠菌和曲霉感染，對真菌感染的排查具有非常重要的價值[1]。但傳統(tǒng)G試驗需要反復(fù)大量采集血液標(biāo)本，不適用于野外作訓(xùn)環(huán)境；且由于技術(shù)條件限制和外界熱源的干擾，誤診和漏診率較高，需要操作技術(shù)的改良和更多標(biāo)本類型的補充替代。本研究旨在運用改良后的G試驗與分子生物學(xué)方法對照并結(jié)合，以提高毛孢子菌的臨床檢出率，找到可代替?zhèn)鹘y(tǒng)標(biāo)本的采集法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

收集從2014年10月—2017年10月，北方某部中心醫(yī)院現(xiàn)有ICU病房中來自基層作訓(xùn)部隊送診的不明原因發(fā)熱和系統(tǒng)衰竭患者和其他來源的ICU或NICU病房內(nèi)所有毛孢子菌易感染人群，如長期臥床使用呼吸機、留置導(dǎo)尿管、移植及植入術(shù)后不明原因高熱、急性呼吸窘迫綜合征、慢性支氣管擴張并發(fā)感染，小兒難治性肺炎和持續(xù)性發(fā)熱等患者共計154例，其中軍隊人員56例，其他人員98例。排除標(biāo)準(zhǔn)：2周內(nèi)進行血透者；靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或其他血液制品者；細(xì)菌菌血癥者；使用多糖類抗癌藥物、放化療藥物者；1周內(nèi)食用菌類食物者。所有患者于入院后第1周、第2周時分別采集血漿1 ml、尿液5 ml；急性呼吸窘迫綜合征、慢性支氣管擴張并發(fā)感染、小兒難治性肺炎患者，于入院第1周和2周時采集支氣管肺泡灌洗液20 ml。訓(xùn)練開放傷后送人員在入院后1周內(nèi)采集傷口分泌物。所有患者均簽署知情同意，并通過倫理委員會審核。

1.2 試劑與儀器

GlucatellTM試劑盒（美國CAPE公司），MK3自動酶聯(lián)測定儀（美國Thermo公司）。DNA提取用Fast DNA?SPIN試劑盒（MP Bio公司）。PCR擴增用TaKaRa Taq?聚合酶、dNTP、限制性核酸內(nèi)切酶及100 bp Ladder均購自寶生物工程（大連）有限公司，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。API 21AUX生化鑒定試劑盒（法國梅里埃公司）。外置游離加熱器（裝置由西安交通大學(xué)機械學(xué)院研制）。全部玻璃器皿及不銹鋼鑷子經(jīng)235℃干烤7 h去除熱原；塑料制品經(jīng)3%雙氧水浸泡4 h后37℃干燥。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察與菌種鑒定

將所有標(biāo)本分別點種于沙堡弱瓊脂培養(yǎng)基（SDA，葡萄糖濃度為4%，不加放線菌酮），22℃培養(yǎng)10 d。10 d后有淡黃色、表面腦回樣皺褶的干酪樣菌落生長，玻片小培養(yǎng)鏡下可見矩形關(guān)節(jié)孢子，API 21AUX生化鑒定為毛孢子菌屬者為陽性，不能同時滿足上述條件者為陰性。

1.4 BG測定

各標(biāo)本等量分置于兩組滅熱源的EP管中，分為實驗A組和實驗B組。根據(jù)G試驗原理，按GlucatellTM試劑盒操作說明進行。實驗A組：將血液、支氣管肺泡灌洗液、尿液標(biāo)本，分別通過外置游離加熱器均勻預(yù)熱處理（160℃，3 h）后，各取100 μl，放入96孔微孔板中，加入主要反應(yīng)試劑G因子50 μl，于37℃加熱板上孵育30 min。 加入終止反應(yīng)的重氮偶聯(lián)試劑，混勻后在540 nm波長濾光片下測定其OD值并自動換算BG濃度值，每次均同時做空白及設(shè)陽性對照。實驗B組除不進行外置游離加熱器預(yù)處理外，所有實驗步驟與A組相同。精密度試驗：將同一標(biāo)本在同一時間用同批號試劑重復(fù)測定25次；將同一份標(biāo)本在不同時間試驗中分別測定25次。結(jié)果判斷：血漿BG濃度＞20 pg/ml為陽性，否則為陰性。

1.5 巢式聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

血漿、支氣管肺泡灌洗液及尿液各100 μl按試劑盒提示步驟提取DNA。引物設(shè)計：ITS1:5'-TCCGTAGGTGAAC-3'，ITS4:5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3'。巢式PCR擴增總反應(yīng)體積為50 μl，94℃預(yù)變性 3 min，94℃ 30 s，57℃ 1 min，72℃1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min；取1 μl首次擴增產(chǎn)物作模板，加入第二對引物及相關(guān)反應(yīng)試劑，經(jīng)94℃預(yù)變性 3 min，94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 40 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。第2次PCR擴增產(chǎn)物10 μl在1.2%瓊脂糖凝膠電泳。質(zhì)量控制：每次PCR擴增分別設(shè)立陽性及陰性對照。陽性對照應(yīng)用β-肌動蛋白；陰性對照用無菌蒸餾水。DNA序列分析：用玻璃奶DNA回收試劑盒對凝膠中的DNA進行回收，并經(jīng)ABI377核苷酸測序儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 毛孢子菌檢出情況

共檢測出不同種類毛孢子菌43株。所有菌株ITS區(qū)均可擴增出539-540 bp的片段，各菌株的酶切圖譜基本一致。其中支氣管肺泡灌洗液15株，血液10株，尿液3，其余15株均來源于野外訓(xùn)練傷開放性傷口分泌物，由于為皮膚淺表感染，不列入本文G試驗與巢式PCR檢測統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2.2 傳統(tǒng)G試驗與改良G試驗比較

對比實驗A、B兩組不同檢測方法的敏感性及特異性，結(jié)果顯示A組與B組相比，敏感性和特異性均有提升，其中敏感性和準(zhǔn)確度的提高有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而假陽性和假陰性率均下降（表1）。入院1周后毛孢子菌感染患者的血漿、支氣管肺泡灌洗液和尿液的BG檢測陽性率較入院2周時高（P＜ 0.05）（表 2）。

2.3 入院1周毛孢子菌感染患者3種體液標(biāo)本及檢測方法敏感性與特異性比較

在血漿和支氣管肺泡灌洗液中改良G試驗敏感性高于巢式PCR擴增，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而巢式PCR的特異性優(yōu)于改良G試驗（表3）。

表1 兩組的敏感性與特異性比較

表2 毛孢子菌感染患者不同入院時間的體液標(biāo)本陽性率比較 （%）

表3 入院1周毛孢子菌感染患者不同標(biāo)本及檢測方法敏感性與特異性的比較

3 討論

侵襲性真菌感染是增加免疫缺陷患者病死率的重要因素之一，因此早期診斷就顯得尤為重要。傳統(tǒng)的診斷需要對相關(guān)組織進行培養(yǎng)和組織病理學(xué)檢查，而血液培養(yǎng)仍然是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)物需要1周以上的生長期與鑒定期，對于侵襲性真菌感染患者來說，這種診斷延遲是致命的[2]。

BG水平對于侵襲性真菌感染具有早期預(yù)警和反應(yīng)感染轉(zhuǎn)歸的重要意義，尤其是在尚未出現(xiàn)感染癥狀時，對BG水平進行連續(xù)監(jiān)測，可以更好地預(yù)防和控制感染的發(fā)生、發(fā)展[3]。但有研究顯示，傳統(tǒng)G試驗在某些患者中存在較高的假陽性率，如革蘭陰性細(xì)菌感染者[4]，這通常是由于標(biāo)本內(nèi)革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素（LTP）的干擾。該成分是革蘭陰性細(xì)菌外膜的組分，一般的高壓滅菌不能使其滅活。因此，筆者在實驗前對標(biāo)本進行了160℃、3 h的改良設(shè)備預(yù)處理，以滅活細(xì)菌內(nèi)毒素這一干擾熱原。由于160℃僅對BG有解螺旋作用，冷卻后，螺旋結(jié)構(gòu)復(fù)性，不影響G試驗數(shù)值的讀取，從而提高了G試驗的敏感性和特異性，降低了假陽性率[5]。同時筆者在人群的篩選上，將腫瘤化療人群進行了剔除，主要原因是這部分患者可能具有多種真菌和細(xì)菌在腔道的定植，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]。

BG水平雖然可以提示有無真菌的感染，甚至評價感染的轉(zhuǎn)歸，但不能確定真菌種類，臨床上往往只能先經(jīng)驗性用藥，并等待培養(yǎng)與藥敏結(jié)果。筆者選擇聯(lián)合分子生物學(xué)巢式PCR擴增以提高毛孢子菌的檢出率和檢測特異性。研究發(fā)現(xiàn)毛孢子菌特異性片段巢式PCR擴增與BG檢測在敏感性上相差不大，但由于PCR擴增的目標(biāo)是真菌的核酸片斷，需要有完整菌體的支持，因此在含有大量吞噬細(xì)胞的血漿和支氣管肺泡灌洗液中敏感性較改良G試驗略低。

兩種檢測方法均顯示支氣管肺泡灌洗液與血漿有著相似的敏感性和特異性，其中改良G試驗在支氣管肺泡灌洗液中的敏感性在入院1周時更優(yōu)于巢式PCR，且避免了傳統(tǒng)檢測需要反復(fù)采血的問題。對于經(jīng)呼吸道感染的毛孢子菌病患者的早期篩查具有良好的應(yīng)用前景。而巢式PCR的高特異性又彌補了G試驗做為非特異性試驗的不足，二者相結(jié)合，可以提高毛孢子菌感染的檢出率、縮短檢出時間。本研究中，尿液中雖然也檢測出BG和特異性DNA片段，但陽性率均較低，且是否與臥床患者的泌尿系真菌的定植相關(guān)，還有待進一步分析。研究發(fā)現(xiàn)，改良G試驗對入院1周的標(biāo)本的敏感性較入院2周時高，分析原因可能與急性感染早期大量吞噬細(xì)胞、吞噬真菌，釋放BG進入體液有關(guān)；2周后，經(jīng)過抗真菌藥物的應(yīng)用，總載菌量減少，因而檢出率有所下降，提示改良G試驗更適用于感染早期的診斷。